荧光定量PCR检测项目专题.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实时荧光定量,PCR,方法,-TaqMan,法,方法：,TaqMan,法,TaqMan-,水解型杂交探针,与目标序列互补,5,端标记有荧光报告基团,(Reporter,R),，如,FAM,、,VIC,等,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher,Q),探针完整，,R,所发射的荧光能量被,Q,基团吸收，无荧光，,R,与,Q,分开，发荧光,Taq,酶有,53,外切核酸酶活性，可水解探针,5,3,5,5,3,5,Forward,Primer,Reverse,Primer,TaqMan,Probe,R,Q,Taqman,实时,PCR,的反应过程,Displacement,5,3,5,5,3,5,Forward,Primer,Reverse,Primer,R,Q,Hydrolysis,5,3,5,5,3,5,Q,R,Polymerization Completed,5,3,5,5,3,5,R,Q,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,实时荧光定量,PCR,定义,在,PCR,反应体系中加入,荧光基团,，利用荧光信号累积,实时监测,整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量,PCR,原理,实时原理,常 规,PCR,技术：,对,PCR,扩增反应的,终点产物,进行定量和定性分析,无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量,PCR,技术：,利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，通过,Ct,值,和标准曲线的分析对,起始模板,进行,定量分析,实时荧光定量,PCR,原理定量原理,如何对起始模板定量？,通过,Ct,值和标准曲线对,起始模板,进行定量分析,介绍三个概念：,扩增曲线、荧光阈值、,Ct,值,扩增曲线,扩增曲线图,：,横坐标：,扩增循环数（,Cycle,）,；,纵坐标：,荧光强度,每个循环进行一次荧光信号的收集,荧光基团,荧光检测元件,荧光,阈,值,荧光信号,阈,值（,threshold,）,：,前,15,个循环信号作为荧光本底信号（,baseline,），即,样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值,荧光域值的缺省设置是,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍,手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段,，并且保证回归系数大于,0.99,真正的信号,:,荧光信号超过域值,Ct,值,Ct,值的定义,：,PCR,扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增,循环次数,C(t)value,Ct,值的重现性,横轴：,PCR,反映循环数,纵轴：荧光信号量,Ct,值的特点,：,相同模板进行,96,次扩增，终点处产物量不恒定；,Ct,值则极具重现性,定量原理,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非理想的,PCR,反应：,X=X,0,(1+Ex),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,定量原理,在扩增产物达到阈值线时,:,X,Ct,=X,0,(1+Ex),Ct,=M (1),X,Ct,:,荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量,.,在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为,M,方程式,(1),两边同时取对数得,:,log M=log X,0,(1+Ex),Ct,(2),整理方程式,(2),得,:,log,X,0,=-log(1+Ex)*,Ct,+log M,(3),Log,浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到,域值的循环数即,Ct,值,就可计算出样品中所含的模板量,标准曲线,模板,DNA,量越多，荧光达到域值的循环数越少，即,Ct,值越小,Log,浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品,Ct,值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的,C(t),值,通过标准曲线由未知样品的,C(t),值推算出其初始量,Sample,绝对定量,25,标本采集和运送,血液标本,：,用,2ml,真空采集管或,1.5ml,高压灭菌离心管采集血液标本，血标本采集后在,2,小时内送达实验室（,HCV,采用,EDTA,抗凝的血浆）。离心（检验单与标本一道）后用一次性吸管吸取血清或血浆加入经消毒的,1.5ml,的离心管中。,脑脊液,：,由临床医生采集后放入消毒的试管中及时送检。,用于临床标本采集的容器如试管或离心管，均应使用前高压灭菌和密封,标本采集后，应尽可能快的送至实验室，如运送时间需,2,小时以上，必须用冰盒送至实验室。,标本中如加入了适当的稳定剂，如用于,RNA,测定加入,4mol/L,异硫氰酸胍盐（,GITC,）的血清（浆）标本和用于,DNA,测定的,EDTA,抗凝血等，则可在室温下运送或邮寄。,注,：,RNA,采用,EDTA,抗凝的全血标本，抗凝后,6,小时内分离血浆，如使用血清标本则尽快（,2,小时内）分离血清。严禁使用肝素抗凝。,定量检测的临床意义,治疗前进行病毒定量检测，指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。,治疗后定量,PCR,直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。,怀孕前进行定量,PCR,测定，有助于选择有利的怀孕时机。,HBV,基因分型,HBV,基因型是根据,HBV,病毒核酸异源性,8%,进行分型,分为,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,等,8,种,亚洲主要为,B,型以及,C,型,感染,HBV,后的临床经过与不同基因型有关,HBV,基因型的临床意义,HBV,标志物清除,与,B,基因型相比，,C,基因型有更高的,HBeAg,阳性率，分别为,16%,与,53%,基因型的自发性,HBeAg,清除要比,C,基因型早,10,年，并且在,HBeAg,清除后，肝脏生物化学指标持续正常。,病毒致病性,HBsAg,阳性者中，,C,基因型比,B,基因型的肝功能异常更为常见。,C,基因型引起的临床表现及组织学损伤更严重。,乙型肝炎的病程及转归,亚洲无症状,HBV,携带中，与,B,基因型比较,C,基因型在肝硬化及,50,岁以上的肝细胞癌患者中比例较高,而,B,基因型与,50,岁以下,特别是,35,岁以下的肝细胞癌患者有关。,药物敏感性,给予干扰素治疗时，,B,基因型的完全应答率达到,C,基因型的,3,倍,HBeAg,阳性乙型肝炎患者使用拉米呋定治疗时,发现,B,基因型患者的,HBeAg/HBeAb,转阴率达到,C,基因型的两倍,HBV,不同基因型比较,B,型,C,型,流行性 低 高,HBeAg,阳性率 低 高,HBeAg,自然清除时间 短 长,HBV DNA,载量 低 高,致病性 轻 重,HCC,发生率 低（低年龄组高）高（高年龄组高）,干扰素治疗完全应答率 高 低,抗病毒治疗效果 好 差,肝癌手术治疗预后 好 差,癌栓栓塞治疗效果 好 差,注意事项,在病毒定量,10,3,时,检测基因分型更有意义,可能出现分型结果出现阴性,排除本身病毒量低的原因外,患者,HBV,基因型可能为非,B,C,型,HBV,拉米夫定,拉米夫定,(,Lamivudine,Heptodin),“,有效,”,核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降低,HBV-DNA,的滴度，改善肝脏组织的病变，还可能阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展。,“,耐药,”,长期服用，会引起,HBV,基因突变，,造成,HBV,对药物敏感性大大降低，从而血清中HBV复制恢复活跃,，滴度升高,。,耐药机理,HBV,聚合酶中,Y(酪氨酸,）,M,（,蛋氨酸,）,D,（,天门冬氨酸,）,D,（,天门冬氨酸),变异毒株的生物特性：对拉米夫定抗病毒效应的敏感性降低至,1,300,，,DNA,减少仅,1,7,。,临床症状：血清,ALT,水平暂时上升，,HBV-DNA,的浓度上升,并有轻度乏力、恶心等肝脏炎症损伤加剧等症状。,I,(,异亮,氨酸,）,V,(,缬,氨酸,）,拉米夫定耐药性,发生率：,治疗慢性乙型肝炎,6,个月后出现耐药性，在亚洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定,1,年，对拉米夫定敏感性降低的病毒变异发生率达,14,，甚至可达,39,。,定义：在持续治疗中血清,HBV DNA,再现,耐药差异：检测灵敏度,基础病毒水平,是否多次,/,多种抗病毒治疗,拉米夫定耐药的临床意义,耐药后的临床情况,：,发生耐药变异后,1,4,个月内虽都有病毒再现，病人的情况也有可能大不相同。,无症状变异病毒携带,部分病人,可能只是病毒再现，血清转氨酶持续正常。所以继续服药仍能抑制,HBV,野生毒株，携带变异毒株因其生活力低，因此并不会发病。,野生毒株转换,有一部分病人停用拉米夫定,3-4,个月后，变异毒株复制活性低，可能被复制活性较高的野生毒株取代。从而出现野生毒株优势感染，成为慢性无症状病毒携或者肝炎复发。,病变急性加重,发生耐药变异继续拉米夫定治疗的病人,ALT,增高，多在半年后病变急性加重。,免疫抑制病人发生严重肝损害,预防及处理,：,治疗,6,个月后，每,3,个月检查,YMDD,和,HBV-DNA,（尤其是基础病毒水平过高或免疫耐受的病人）,