SDS-PAGE原理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,采用十二烷基硫酸钠,-,聚丙稀酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,，,polyacrylamide gel electrophoresis,）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为,SDS-PAGE,不连续系统。基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（,acrylamide,）和,N,N-,亚甲基双丙稀酰胺（,N,N-methylene bis acrylamide,）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（,tetramethylethylenediamine,，,TEMED,）和过硫酸胺（,ammonium persulfate,，,AP,）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。,SDS,聚丙浠酰胺凝胶电泳原理,采用十二烷基硫酸钠,-,聚丙稀酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,，,polyacrylamide gel electrophoresis,）方法可对蛋白质的组分进行分离，并可精确测得蛋白质的分子量。常用的方法为,SDS-PAGE,不连续系统。基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺（,acrylamide,）和,N,N-,亚甲基双丙稀酰胺（,N,N-methylene bis acrylamide,）经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（,tetramethylethylenediamine,，,TEMED,）和过硫酸胺（,ammonium persulfate,，,AP,）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。,SDS,聚丙浠酰胺凝胶电泳原理,(acrylamide),丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料。聚丙烯酰胺主要用于水的净化处理、纸浆的加工及管道的内涂层等。淀粉类食品在高温（,120,）烹调下容易产生丙烯酰胺。,研究表明，人体可通过消化道、呼吸道、皮肤黏膜等多种途径接触丙烯酰胺，饮水是其中的一条重要接触途径。,丙烯酰胺进入体内又可通过多种途径被人体吸收，其中经消化道吸收最快。进入人体内的丙烯酰胺约,90,被代谢，仅少量以原形经尿液排出。丙烯酰胺进入体内后，会在体内与,DNA,上的鸟嘌呤结合形成加合物，导致遗传物质损伤和基因突变。,对接触丙烯酰胺的职业人群和偶然暴露于丙烯酰胺人群的调查表明，丙烯酰胺具有神经毒性作用，但目前还没有充足的证据表明通过食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显关系。,丙烯酰胺,丙烯酰胺简介,丙烯酰胺是一种有机化合物，别名,AM,；纯品为白色结晶固体，易溶于水、甲醇、乙醇、丙醇，稍溶于乙酸乙酯、氯仿，微溶于苯，在酸碱环境中可水解成丙烯酸。职业性接触主要见于丙烯酰胺生产和树脂、黏合剂等的合成，在地下建筑、改良土壤、油漆、造纸及服装加工等行业也有接触机会。日常生活中，丙烯酰胺可见于吸烟、经高温加工处理的淀粉食品及饮用水中。,毒性,丙烯酰胺属中等毒类，对眼睛和皮肤有一定的刺激作用，可经皮肤、呼吸道和消化道吸收，在体内有蓄积作用，主要影响神经系统，急性中毒十分罕见。密切大量接触可出现亚急性中毒，中毒者表现为嗜睡、小脑功能障碍以及感觉运动型多发性周围神经病。长期低浓度接触可引起慢性中毒，中毒者出现头痛、头晕、疲劳、嗜睡、手指刺痛、麻木感，还可伴有两手掌发红、脱屑，手掌、足心多汗，进一步发展可出现四肢无力、肌肉疼痛以及小脑功能障碍等。丙烯酰胺慢性毒性作用最引人关注的是它的致癌性。丙烯酰胺具有致突变作用，可引起哺乳动物体细胞和生殖细胞的基因突变和染色体异常。动物试验研究发现，丙烯酰胺可致大鼠多种器官肿瘤，如乳腺、甲状腺、睾丸、肾上腺、中枢神经、口腔、子宫、脑下垂体肿瘤等。但目前还没有充足的人群流行病学证据表明，食物摄入丙烯酰胺与人类某种肿瘤的发生有明显相关性。国际癌症研究机构（,IARC,）对其致癌性进行了评价，将丙烯酰胺列为,2,类致癌物（,2A,），即人类可能致癌物。其主要依据为，丙烯酰胺在动物和人体均可代谢转化为致癌活性代谢产物环氧丙酰胺。,预防,职业性接触者要通过改革工艺、采取工程技术措施等手段，降低工作场所空气中丙烯酰胺的浓度；同时通过加强个人防护，如戴口罩、手套，穿防护服和鞋等，以防止或减少丙烯酰胺进入体内。日常生活中尽量避免过度烹饪食品，如温度过高或加热时间太长。提倡平衡膳食，减少油炸和高脂肪食品的摄入，多吃水果和蔬菜，不要吸烟。由于煎炸食品是我国居民常吃的食物，国家应加强膳食中丙烯酰胺的监测与控制，开展我国人群丙烯酰胺的暴露评估，并研究探索减少加工食品中丙烯酰胺含量的方法,（,N,N-methylene bis acrylamide,）,N.N-,亚甲基双丙烯酰胺，别名,MBA,，双叫,N.N-,甲叉双丙烯酰胺，次甲基双丙烯酰胺，,N.N-,甲撑双丙烯酰胺。是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇。,丙烯酰胺单体和交联剂,N1 N-,亚甲基双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链。相邻的两个链通过亚甲基桥交联起来就形成三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。,N,N-,亚甲基双丙烯酰胺又名甲撑双丙烯酰胺,英文缩写名,MBA,为白色或浅黄色粉末状结晶,毒性低,对皮肤无刺激,无神经毒性,溶于水及乙醇、丙酮等有机溶剂。在它的结构中具有两个相同且非常活泼的反应性官能团,可作为交联剂,能将线性高分子迅速转变为体型高分子,制备吸水性聚合物,还可与各种离子型单体发生聚合反应,使其在石油开采以及医药、水处理等行业具有广泛用途。,N.N-,亚甲基双丙烯酰胺（甲叉）,TEMED(N,N,N,N-,四甲基二乙胺,),产品简介：,TEMED,即,N,N,N,N-Tetramethylethylenediamine,，中文名为,N,N,N,N-,四甲基二乙胺。分子式为,(CH3)2NCH2CH2N(CH3)2,，分子量为,116.20,。,进口分装，用于配制,PAGE,胶等。,TEMED,通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。,加入加速剂,TEMED,后聚合马上开始，应立即将凝胶混匀，迅速灌胶。,保存条件：,4,保存。,注意事项：,易燃，有腐蚀性，请注意防护。,为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。,不连续系统由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。浓缩胶（,pH6.7,，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。分离胶（,pH8.9,，孔径小）通过分子筛效应和电荷效应，把样品中的各组分按分子量和电荷的大小而分开。如果要利用凝胶电泳测定某一蛋白质的分子量就必须将电荷效应去掉或减少到可以忽略不计的程度，使蛋白质泳动率的大小完全取决于分子量。如何去除电荷效应呢？现常用的是十二烷基硫酸钠（,SDS,）。,SDS,是一种阴离子去污剂。在电泳体系中加入一定浓度的,SDS,，,SDS,以一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，从而减低或消除了各种蛋白质分子天然电荷的差异。,十二烷基硫酸钠,SDS,是阴离子型表面活性剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，再与,PAGE,技术结合，则谱带差异更加明显、清晰，并可测定蛋白质分子量。,在有去污剂十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳。,SDS-PAGE,只是按照分子大小分离的，而不是根据分子所带的电荷和大小分离的。,SDS,带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用,Mr,差异将各种蛋白质分开。,最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由,Ornstein(1964),和,Davis(1964),设计的,样品和浓缩胶中含,Tris-HCl(pH 6.8),上下槽缓冲液含,Tris-,甘氨酸,(pH 8.3),分离胶中含,Tris-HCl(pH 8.8),。系统中所有组分都含有,0.1%,的,SDS(Laemmli,1970),。样品和浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域,它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处,pH,值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，,SDS-,蛋白质复合物成一电位和,pH,值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。,甘氨酸,浓缩效应：,凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分离胶。浓缩胶为大孔胶，缓冲液,pH6.7,，分离胶为小孔胶，缓冲液,pH8.9,。在上下电泳槽内充以,Tris,甘氨酸缓冲液,(pH8.3),，这样便形成了凝胶孔径和缓冲液,pH,值的不连续性。在浓缩胶中,HCl,几乎全部解离为,Cl-,，但只有极少部分甘氨酸解离为,H2NCH2COO-,。蛋白质的等电点一般在,pH5,左右，在此条件下其解离度在,HCl,和甘氨酸之间。当电泳系统通电后，这,3,种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为,Cl-,蛋白质,H2NCH2COO-,，故,C1-,称为快离子，而,H2NCH2COO-,称为慢离子。电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子和慢离子之间形成,个稳定而不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩成,条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。,电荷效应,：样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质，高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而形成一条条区带。但在,SDS-PAGE,电泳中，由于,SDS,这种阴离子表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物，使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基组成的蛋白质和,SDS,结合后都解离成亚单位，这是因为,SDS,破坏了蛋白质氢键、疏水键等非共价键。与,SDS,结合的蛋白质的构型也发生变化，在水溶液中,SDS-,蛋白质复合物都具有相似的形状，使得,SDS-PAGE,电泳的泳动率不再受蛋白质原有电荷与形状的影响。因此，各种,SDS-,蛋白质复合物在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的不同。,Acr-Bis,产品简介：,40%Acr-Bis(39:1),即为含,40,acrylamide-bisacrylamide,的水溶液，其中,acrylamide,和,bisacrylamide,的比例为,39:1,。,40%Acr-Bis(39:1),常用于配制各种,PAGE,凝胶，例如,EMSA,凝胶、,RPA,凝胶等，可以用于蛋白或核酸等的分离，是实验室的常用储备液。,保存条件：,4,避光保存。,注意事项：,40%Acr-Bis(39:1),有一定毒性，使用时请注意适当防护。,为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。,聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体（,Acrylamide,，简写为,Acr,）和交联剂,N,，,N-,甲叉双丙烯酰胺（,N,N-Methylena Bisacrylamide,，简写为,Bis,）在催化剂的作用下聚合而成的。,Acr,和,Bis,在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。,电泳槽,SDS-PAGE,蛋白电泳上样缓冲液,蛋白上样缓冲液,(SDS-PAGEloadingbuffer),是一种以溴酚蓝为染料，,5,倍浓缩的,SDS-PAGE,凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的,SDS-PAGE,蛋白电泳样品上样。本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离，在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务必注明，仔细区分。,注意事项 分为还原型和非还原型两种，还原型上样缓冲液中含一定量的,DTT,或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较易区分；含巯基的试剂有一定的毒性，为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。,使用说明,1.,按每,4,微升蛋白样品加入,1,微升蛋白上样缓冲液的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液,(5X),。,2.100,或沸水浴加热,3-5,分钟，以充分变性蛋白。,3.,冷却到室温后离心数秒钟，混均后再离,30,秒钟，取上清直接上样到,SDS-PAGE,胶加样孔内即可。,4.,通常电泳时染料到达胶的底端附近（,0.5-1cm),即可停止电泳。,增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。,上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。,指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿。,SDS-PAGE,蛋白电泳上样缓冲液,单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于,Carnoy,首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。,Carnoy,固定液（甲醇,:,冰乙酸,=3:l,）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间,15,分钟至,24,小时，冰箱、室温均可。,甲醇,：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差,(,亲和力小且易自溶,),。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大,(,可收缩,20,左右,),，可使材料变硬。,冰醋酸,：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。常用,0.3-0.5,的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。,甲醇,/,冰醋酸固定液,考马斯亮蓝（,Coomassie Brilliant Blue,）,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质,染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。,考马斯亮蓝,G250,存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（,Beers law,）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由,465nm,变成,595nm,，通过测定,595nm,处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。,蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约,2min,即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定,1h,，之后，蛋白质,染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质,染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质,5L/ml,时就有,0.275,光吸收值的变化，比,Lowry,法灵敏,4,倍，测定范围为,10,100g,蛋白质，微量测定法测定范围是,1,10g,蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。,考马斯亮蓝,G-250,（,Coomassie brilliant blue G-250,）,测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝,G-250,在游离状态下呈红色，最大光吸收在,488nm,；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质,-,色素结合物在,595nm,波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝,G-250,结合在,2min,左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下,1h,内保持稳定。该法是,1976,年,Bradford,建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比,Lowry,法还高,4,倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为,0,1 000g,mL,，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。,Triton-100,Triton-100,洗涤剂 透压的裂解去垢剂（）通过形成微团能溶解细胞膜的疏水结构。是温和的，非离子的去垢剂，不会使得蛋白质变性（相比较接下来即将要,用到的,SDS,来说）。,