在小鼠脑血管内皮细胞中用发夹寡核苷酸调控由细胞因子诱导的iNOS的表达.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,本文主要内容,在,MCEC,中，,TNF-,和,IFN-,的组合可增强,iNOS,的表达；,在,MCEC,中，,NF-B,对由,TNF-,及,IFN-,诱导,iNOS,的表达起介导作用；,设计了一个携带,NF-B,基序的双链发夹寡核苷酸，并证明该核苷酸可以抑制上述作用。,背景资料,一氧化氮合酶（,NOS,）的三种同工酶：,神经元型一氧化氮合酶（,Neuronal nitric oxide synthase,，,nNOS,或,NOS1,）,内皮型一氧化氮合酶（,Endothelial nitric oxide synthase,，,eNOS,或,NOS3,）,诱导型一氧化氮合酶（,Inducible nitric oxide synthase,，,iNOS,或,NOS2,）,促炎性细胞因子：,肿瘤坏死因子,-,（,Tumor necrosis factor alpha，TNF-,）,干扰素,-,(,Interferon gamma，IFN-,),背景资料,细胞因子可通过核转录因子,-,B,（,Nuclear factor kappa-B,，,NF-,B,）的发挥它们的作用，以改变基因表达。,在小鼠脑血管内皮细胞（,MCECs,）中，,IFN-,与,TNF-,的共同作用能增加的,NF-kB,（与,DNA,）的结合力（,binding,），进一步增加,iNOS,的表达。,转录因子活性可以通过反义寡核苷酸（,Antisense oligonucleotides,）或双链哑铃寡核苷酸（,Double-stranded dumbbell oligonucleotides,）来调节。,实验目的,测试含有,NF-B,结合位点（,binding site,）共有序列的双链发夹（,Hairpin,，,HP,）寡核苷酸的功效,（有效抑制细胞因子诱导的,iNOS,表达）。,实验方法,对,iNOS,表达的诱导,含,TNF-(20 ng/ml),、,IFN-(1,000 units/ml),的培养基,时间梯度,对,iNOS,表达的调节,NF-kB,发夹核苷酸,(1M),或突变型,NF-kB,发夹核苷酸,(1M),TNF-,、,IFN-,诱导前,3h,加入（预处理）,MCEC,核提取物的制备,每样约,500,万个细胞,RNA,分离（,TRI reagent,法）,实验方法,发夹由,TTTTT,连接环建立，在,NF-kB,的共识寡核苷酸标有,-,32,P-ATP,室温下孵育（结合反应，,Binding reaction,）后非变性电泳,放射自显影,电泳迁移分析,NF-kB,的共有寡核苷酸,5,-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3,(32),HP,寡核苷酸,AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCTT,T,TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCGTT,突变,HP,寡核苷酸,AGTTGAGTCTACGCTAACAGGCTT,T,TCAACTCAGATGCGATTGTCCGTT,实验方法,RT-PCR,亲环蛋白（内参基因引物）,:,+5-ATGGTCAACCCCACCGTGT-3;,-5-CGTGTGAAGTCACCACCCT-3(220 bp).,iNOS,（目的基因引物）,:,+5-TATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCT-3;,-5-TAGATACATCCACACCGTTTAGCGG-3(300 bp).,蛋白印迹（见,Promega,技术手册）,实验结果,图,1 MCEC,中,HP,寡核苷酸及其突变体对,NF-kB,结合活性的影响,TNF-,+IFN-,增加,MCEC,中,NF-kB,的结合活性（图,1A,）,1.,空白对照,2.,未处理（对照）组,3.TNF-,+IFN-,处理组,TNF-,+IFN-,处理后，,MCEC,中,NF-kB,的结合活性是原来的,3,倍以上！,实验结果,图,1 MCEC,中,HP,寡核苷酸及其突变体对,NF-kB,结合活性的影响,同一凝胶板下,HP,寡核苷酸及其突变体对,NF-kB,结合活性的影响（图,1B,）,1.,空白对照,2.,核蛋白（同,1A,处理组）,+NF-kB,标记探针,3.20NF-kB,非标记探针,4.20HP,寡核苷酸预处理影响组,5.20,突变,HP,寡核苷酸预处理影响组,TNF-,+IFN-,处理后，发夹寡核苷酸预处理操作能抑制,NF-B,结合活性，而突变发夹寡核苷酸预处理操作对,NF-B,结合活性则没有效果！,实验结果,图,2,MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对,TNF-+IFN-,诱导,iNOS,表达的影响（,RT-PCR,检测）。,TNF-,+IFN-,增加,MCEC,中,iNOS,的表达（图,2A,）,1.TNF-,+IFN-,处理后,0h,（未处理组）,2.TNF-,+IFN-,处理后,1h,3.TNF-,+IFN-,处理后,3h,4.TNF-,+IFN-,处理后,5h,5.TNF-,+IFN-,处理后,24h,TNF-,+IFN-,处理后，,MCEC,中,iNOS mRNA,瞬时表达。大约,3,小时后增加达到峰值，大约是未处理时的,8,倍！,实验结果,图,2,MCEC中HP寡核苷酸和它的突变体对,TNF-+IFN-,诱导,iNOS,表达的影响（,RT-PCR,检测）。,HP,寡核苷酸及其突变体对,iNOS mRNA,表达的抑制（图,2B,）,1.TNF-,+IFN-,处理后,0h,（未处理组）,2.TNF-,+IFN-,处理后,3h,3.TNF-,+IFN-,处理后,3h+HP,寡核苷酸,3h,前预处理,4.TNF-,+IFN-,处理后,3h+,突变,HP,寡核苷酸,3h,前预处理,根据,RT-PCR,，,HP,寡核苷酸对,iNOS,在相对,mRNA,表达水平的降低率为,8015,（平均值,SD,，,N=3,）！,实验结果,图,3,MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有,CHX,对,TNF-+IFN-,诱导,iNOS,表达的影响（蛋白印迹检测）。,HP,寡核苷酸对,iNOS,的表达的抑制作用（图,3A,）,1.iNOS,标准品,2.,未处理组,3.TNF-,+IFN-,处理后,16h,4.TNF-,+IFN-,处理后,16h+HP,寡核苷酸,3h,前预处理,5.TNF-,+IFN-,处理后,16h+,突变,HP,寡核苷酸,3h,前预处理,TNF-+IFN-,处理也诱导,iNOS,在蛋白水平上的表达（增加倍数,82,，,N=3,）！,HP,寡核苷酸（而非突变体）预处理，也抑制由,TNF-/IFN-G,诱导,iNOS,在蛋白水平上的表达！,基于,130 kD,频带密度法，,iNOS,蛋白表达的减少率为,9020,（,N=3,）！,实验结果,图,3,MCEC中HP核苷酸及其突变体，还有,CHX,对,TNF-+IFN-,诱导,iNOS,表达的影响（蛋白印迹检测）。,放线菌酮,(Cycloheximide,，,CHX,）对,iNOS,的表达的抑制作用（图,3B,）,1.iNOS,标准品,2.,未处理组,3.TNF-,+IFN-,处理后,16h,4.TNF-,+IFN-,处理后,16h+CHX,（前者处理,10h,后加入）,5.TNF-,+IFN-,处理后,16h+CHX,（与前者同时加入）,当用,TNF-+IFN-,的同时给予一种蛋白质合成抑制剂,放线菌酮，可以废除,iNOS,表达！,当,CHX,被加入到,TNF-+IFN-,处理,10,小时后的,MCEC,，则未能抑制,iNOS,的表达！,讨论与展望,使用了结构改性的寡核苷酸,发夹,NF-kB,的基序，以限定,MCEC,中,NF-B,在,iNOS,表达时的作用。双链发卡寡核苷酸包含与,TTTTT,连接环中的,NF-kB,的共有序列。通过,GGGACTTTCC,被,TCTACGCTAA,取代突变作为对照。,该发夹寡核苷酸（而非其突变体）可有效地对,NF-kB,结合力（,Binding,）起竞争作用。,发夹寡核苷酸也抑制由,TNF-+IFN-,的诱导,iNOS,的表达，这表明,iNOS,基因表达是由,NF-B,的在转录水平调控。而通过蛋白印迹分析则进一步被发现该发夹寡核苷酸在蛋白质水平上的效果是不完整的。这是因为,iNOS,这至关重要的基因表达不可能仅由一个转录因子调节。,CHX,没有减少,iNOS mRNA,表达（数据未示出），而当,MCECs,用,TNF-+IFN-,和,CHX,同时进行处理时却完全抑制,iNOS,的表达。但是,CHX,并不能对,10,小时,TNF-+IFN-,预处理后,MCECS,中,iNOS,的表达进行抑制。这表明，,iNOS,的关键阶段合成发生在细胞因子刺激的早期阶段。,并表明一个设计适当的发夹,NF-kB,的基序可以替代的药理学手段，来调节细胞因子诱导的,iNOS,表达,谢谢观赏,马酉初,|,2016.9.19,|,中南林业科技大学,