53血红蛋白的提取和分离课件.pptx

课题课题3 3 血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离蛋白质提取与分离的依据蛋白质提取与分离的依据 蛋白质的物理化学性质：蛋白质的物理化学性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、对其他分子的亲和力等千差万别。附性质、对其他分子的亲和力等千差万别。分离分离方法方法凝胶色谱法凝胶色谱法 凝胶电泳法凝胶电泳法 一、基础知识一、基础知识:一、基础知识：一、基础知识：（一）（一）凝胶色谱法（分配色谱法）：凝胶色谱法（分配色谱法）：1 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖）2 2、概念：根据、概念：根据相对分子质量的大小相对分子质量的大小分离分离蛋白质的方法蛋白质的方法3 3、原理：、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（对（）的蛋白质容易进入）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（凝胶内部的通道，路程（），移动速），移动速度（度（），而（），而（）的蛋白）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（）移动，路程（），移动速度（），移动速度（），），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小相对分子质量较小较长较长较慢较慢相对分子质量较大相对分子质量较大凝胶外部凝胶外部较短较短较快较快大分子通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；大分子通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。小分子穿过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。4 4、分离过程、分离过程 混合物混合物上上 柱柱洗洗脱脱大分子流动快大分子流动快小分子流动慢小分子流动慢收收 集集大分子大分子收收 集集小分子小分子 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。促使蛋白质分子的差速流动。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成。如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3、NaHNaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等缓冲溶液洗脱剂缓冲溶液洗脱剂组成：组成：配制：配制：作用：作用：调节缓冲剂的比例，配制不同调节缓冲剂的比例，配制不同pHpH的缓冲液。的缓冲液。抵制外界酸碱对溶液抵制外界酸碱对溶液pHpH的干扰而保持的干扰而保持 pHpH稳定。稳定。（二）、缓冲溶液（二）、缓冲溶液2 2凝胶电泳法：凝胶电泳法：（1 1）原理：）原理：待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。分离。(三三)电泳电泳1.1.电泳的概念电泳的概念指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程.在凝胶中加入在凝胶中加入SDSSDS，形成，形成“蛋白质蛋白质SDSSDS复合物复合物”，SDS SDS所带负电荷的量大大超所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了过了蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，不同蛋白质间的电荷差别，使蛋白质迁使蛋白质迁移速率移速率仅取决于分子大小仅取决于分子大小。（2 2）分离方法：）分离方法：（3 3）分离过程：）分离过程：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。电泳检测结果电泳检测结果琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定 血液组成血液组成成分成分 1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞 2.释放释放血红蛋白血红蛋白 3.分离分离血红蛋白血红蛋白 4.透析透析血红蛋白血红蛋白二、实验操作二、实验操作血液组成成分血液组成成分阅读思考：阅读思考：1.1.血液由血液由_和和_ _两部分组成。两部分组成。2.2.血细胞中血细胞中_细胞数量最多，红细胞的含细胞数量最多，红细胞的含量最高的有机化合物是量最高的有机化合物是_。3.3.该化合物是由该化合物是由 _和和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O O2 2和和COCO2 2结合的结合的_基团。基团。血浆血浆血细胞血细胞红细胞红细胞血红蛋白血红蛋白2条条-肽链肽链2条条-肽链肽链 亚铁血红素亚铁血红素返回返回1.1.洗洗 涤涤 红红 细细 胞胞阅读思考：阅读思考：洗涤的目的洗涤的目的是什么？是什么？洗涤过程：洗涤过程：血液血液100mL100mL3g3g柠檬酸钠柠檬酸钠低速离心低速离心2 min2 min红细胞红细胞血血 浆浆吸出血浆吸出血浆红细胞红细胞5倍体积生理盐水倍体积生理盐水搅拌搅拌10min重复洗涤重复洗涤3 3次，直至上清液没有黄色次，直至上清液没有黄色去除杂蛋白去除杂蛋白采集得到猪血采集得到猪血初次离心后的结果初次离心后的结果3 3次洗涤后的结果次洗涤后的结果返回返回2.2.释放血红蛋白释放血红蛋白蒸馏水的作用是蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂加速红细胞的破裂 加加蒸馏水蒸馏水到原血液体积，再加到原血液体积，再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于，置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅上充分搅拌拌1010分钟（加速细胞破裂）分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释细胞破裂释放出血红蛋白。放出血红蛋白。磁力搅拌器磁力搅拌器返回返回3.3.分离血红蛋白分离血红蛋白分离过程分离过程红细胞红细胞混合液混合液高速离心高速离心10min 离心管离心管滤纸滤纸过滤过滤脂溶物质脂溶物质烧杯烧杯分离血红蛋白溶液分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 （无色透明的甲苯层）（无色透明的甲苯层）脂类物质脂类物质 （白色白色脂溶性物质沉淀层）脂溶性物质沉淀层）血红蛋白溶液血红蛋白溶液 （红色透明液体）（红色透明液体）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）红细胞破碎物沉淀（暗红色沉淀物）4.4.透析血红蛋白透析血红蛋白20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液1mL1mL利用透析袋透析利用透析袋透析透析过程透析过程返回返回纯化凝胶色谱操作纯化凝胶色谱操作1.1.凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的制作制作：2.2.凝胶色谱柱的凝胶色谱柱的装填装填：3.3.样品的样品的加入和洗脱加入和洗脱（二）凝胶色谱操作（二）凝胶色谱操作 （1 1）凝胶色谱柱的制作）凝胶色谱柱的制作材料：交联葡聚糖凝胶材料：交联葡聚糖凝胶G-75G-75；20mmol/L 20mmol/L磷酸缓冲液磷酸缓冲液装填装填:2.2.凝胶色谱柱的装填：凝胶色谱柱的装填：步骤步骤操作要求操作要求立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液装填悬浮液凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴 凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液配制悬浮液计算称量凝胶计算称量凝胶固定色谱柱固定色谱柱（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配制凝胶悬浮液：配制凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱装置固定在将色谱柱装置固定在支架上。支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝、装填凝胶柱时不得有气泡存在：胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果洗脱次序，降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓磷酸缓冲液（冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤充分洗涤平衡平衡1212小时小时。注意：注意：1 1、洗、洗脱液面不要低于凝胶表面，脱液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱3.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，滴样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到适的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集收集一试管，连续收集。（在分离过程中，。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：注意：注意：注意：正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。3.3.样品的加入和洗脱样品的加入和洗脱3.3.样品加入与洗脱样品加入与洗脱注意：注意：注意：注意：正确的加样操作是：正确的加样操作是：1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。收集得到的纯化后的血红蛋白收集得到的纯化后的血红蛋白注意事项注意事项1.1.红细胞的洗涤：红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.2.凝胶的预处理：凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡3.3.色谱柱的装填：色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。液不能断流。4.4.色谱柱成功标志：色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。红色区带均匀一致地移动。观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见（见教科书图教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。后续血红蛋白的提取纯度。三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价 1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？描述处理后的样品发生了哪些变化吗？三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖有色物质，例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖，或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。除不了时要重新装柱。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。3 3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？据此判断分离效果？三、实验结果分析与评价三、实验结果分析与评价知识总结知识总结血血红红蛋蛋白白的的提提取取和和分分离离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法凝胶色谱法原原 理理分离过程分离过程凝胶电泳法凝胶电泳法缓冲溶液缓冲溶液组组 成成作作 用用蛋白质的蛋白质的提取分离提取分离样品处理样品处理粗粗 分分 离离纯纯 化化纯度鉴定纯度鉴定