基因与基因工程以及转基因产品的安全性评价.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,今天，从遗传学研究衍生出来的,基因工程,技术，已构成,生物技术,的核心，在实际应用中显示出极大的潜力。,第四讲 从基因到基因工程,一、,孟德尔学说奠定了遗传学基础,二、,基因是一段DNA序列,三、,基因工程的操作和应用,一、孟德尔学说奠定了遗传学基础,在孟德尔以前，人们看到遗传现象，猜想遗传是有规律的，甚至在农牧业育种中实际运用了遗传规律，但是，一直找不到研究遗传规律的恰当方法。,返回,G.Mendel,，,奥地利修道士，,1822,年,1884,年，现代遗传学的奠基人。,1857,年开始豌豆遗传实验，,8,年后公布研究成果，,1866,年发表了,“,植物杂交实验,”,的划时代论文。否定了当时流行的所谓,融合遗传,，确定了遗传物质的存在和遗传学的两个基本规律：,分离定律,和,自由组合定律,。,1900,年，研究才引起遗传学家、育种家的高度重视。,返回,豌豆杂交操作,孟德尔研究的七对性状,1、孟德尔第一定律,分离律,他用一对性状杂交，子一代全为显性性状，子一代之间自交，子二代为：,显性性状：隐性性状3：1,返回,孟德尔分离律,真实遗传：,基因是纯合的生物，可以繁衍和自身一样的子代。,杂合体,不能真实遗传,白化病：,为单基因病，其致病基因是隐性的，基因为AA、Aa的正常，aa则为病人，但Aa的后代会出现病人。禁止近亲结婚；杂交稻，不可做种子,分离定律的实践意义,2、孟德尔第二定律,自由组合律,他用两对性状杂交，子一代全为显性性状，子一代之间杂交，子二代出现四种性状，其数量比例为,9：3：3：1,返回,孟德尔自由组合律,黄圆,绿圆,黄皱,绿皱,3、孟德尔学说的要点,依据上面的试验结果，孟德尔认为，每株豌豆植株中的每一对性状，都是由,一对遗传因子,所控制的，遗传因子有,显性,因子和,隐性,因子之分。,当一株植株中控制某一对性状的一对遗传因子均为,隐性,因子时，该植株才表现出,隐性,性状（如白花或绿色豆粒）。其他情况下，包括一对遗传因子均为,显性,，或一个,显性,一个,隐性,，均表现出,显性,性状（如紫花或黄色豆粒）。这一点在分离律实验中看的很清楚。,当两对性状一起加以研究时,显性和隐性的基本规律仍与上面相同,但要加上一条,控制不同性状的遗传因子,在传代中各自独立,互不干扰,出现,自由组合,现象。,返回,孟德尔自由组合律,黄圆,绿圆,黄皱,绿皱,4、孟德尔学说的重要意义,（1）孟德尔第一次明确提出,遗传因子,的概念,并且提出了遗传因子控制遗传性状的,若干规律,：,大多数生物体通常由,一对遗传因 子,（后来称为两个等位基因）,控 制同一性状。这样的生物体称为 2n 个体。,遗传因子可以区分为,显性,和,隐性,。,控制不同性状的遗传因子是,各自 独立的,。,（2）孟德尔提出了,杂交,、,自交,、,回交,等一套科学有效的遗传研究方法，来研究遗传因子的规律。孟德尔创立的这套方法一直沿用到 1950s，才被,分子遗传学方法,取代。,为何选择豌豆？,豌豆是一种自花授粉的植物，人工去雄比较方便，容易栽种、分离和杂交，还具有一系列稳定可遗传的性状，非常巧合每一染色体上只有决定同一性状的基因，豌豆的,7,对性状正好分别位于仅有的,7,条染色体上。,但孟德尔自由组合定律无法解释不同性状位于同一染色体上相距不远的情况，同源染色体上的不同对基因所控制的不同性状并不是自由组合的,连锁和交换定律,思考题,已知：控制鹦鹉羽毛颜色的有四个等位基因（即两对基因）：,B、b、C、c,。,B使羽毛颜色呈,黄色,C使羽毛颜色呈,蓝色,b和c是隐性基因，不产生色素。,下图,返回,问,：,（,1,）写出图中四个鹦鹉的基因型。（,2,）基因型为,BbCc,的鹦鹉应为什么颜色？（,3,）两只基因型为,BbCc,的,鹦鹉所产,生的后代是什么情况？,5、连锁和交换定律,摩尔根,以果蝇为研究材料，研究连锁、交换和伴性遗传等，把遗传学和细胞学结合起来，确立并发展了染色体的遗传学说。,把遗传因子命名为基因（,gene,），因此染色体遗传学说也称基因学说。,连锁（linkage）,连锁群（,linkage groups,）,交换（,crossing over,）,Fruit Fly,Drosophila melanogaste,r,(SEM X60).,染色体,4,对,，形态各不相同，容易区别。基因组长1.8,1,0,8,bp,，有1,2000,个基因。推测人类,80%,的人类基因与之有同源性。已发现1,00,余个人类疾病基因在果蝇中发现。,果蝇用做遗传研究有其优势,灰身残翅,黑身长翅,亲代,F1配子,F1侧交,F2,B,v,B,v,b,V,b,V,B,v,b,V,b,v,b,v,B,v,b,V,b,v,B,v,b,V,b,v,b,v,灰身长翅,黑身残翅,灰身残翅,黑身长翅,同自由组合定律不符,原因：形成配子时，各位于同一染色体上的基因B和v及b和V没有分开，有连锁存在,连锁（,linkage,）,:,同一染色体上的遗传因子连在一起一同遗传的现象。,连锁群（,linkage group,）,：,许多基因按照一定的顺序排列在同一条染色体上，相互连锁，构成一个连锁群,连锁是生物遗传中的普遍现象，一个生物具有的连锁群数目往往就是生物细胞内染色体的对数,灰身残翅,黑身长翅,亲代,F1 配子,F1侧交,F2,B,v,B,v,b,V,b,V,B,v,b,V,b,v,b,v,B,v,b,V,b,v,灰身长翅,黑身残翅,灰身残翅,黑身长翅,b,v,BV,B,v,b,V,b,v,B,V,b,v,b,v,b,v,b,v,黑身残翅,灰身长翅,41.5%,41.5%,8.5%,8.5%,交换（,crossing over,）,:两,个同源染色体上对应节段上相互交换，引起遗传因子基因间的交换重组。,C S,c s,C S,c s,C S,C s,c S,c s,亲组合：（41.5%+41.5%）占83%,重组合：（8.5%+8.5%）占17%,二、,基因是一段 DNA 序列,“,遗传因子/基因,”的设想一经提出，便推动人们去寻找，去探索,基因在哪里？,基因是什么？,1、基因在染色体上,显微镜技术与染色技术的发展，使人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的,等位基因,的分离规律相当一致，所以，,确定基因在细胞核中，在染色体上,。,返回,同源染色体分别带着控制,同一性状的两个,等位基因,显性等位基因,纯合子,隐性等位基因,纯合子,杂合子,摩根实验室用果蝇为材料的工作，确定了基因在染色体上的分布规律。,下图,野生果蝇,没有现成的成对性状,摩儿根在长期饲养中找到各个性状的,突变株,。,控制不同性状的等位基因,在2,#,染色体上的位置,触须,长/短,身体,灰/黑,眼睛,红/紫,翅,长/短,下图,减数分裂时发生：染色体交叉/基因重组。,返回,g,身体,c,眼睛,l,翅,灰,/黑,红,/紫,长,/短,基因重组服从这样的规则：,两个基因在染色体离得越远，重组频率越高；,两个基因在染色体上离得越近，重组频率越低。,重 组 频 率,随着生物化学的发展，蛋白质、核酸等生物大分子逐渐分离、纯化出来。各方面的实验证据表明，基因的化学本质不是蛋白质，而是 DNA。格里菲斯的实验证明遗传物质可以,转化,进入细菌，改变细菌特性。,爱弗莱的实验证实，进入细菌改变特性的遗传物质是,DNA,，而不是,蛋白质,。,2、遗传物质是 DNA,下图,1944年，O.T.Avery的细菌转化实验,结论：抽提液中含有一种转化因子,下图,*转化因子的证实,1944 Avery,（美 微生物学家）,从S抽提液纯化转化因子,因此：,Avery,是首先用实验证明基因的化学本质就是,DNA,的科学家,分别用放射性同位素标记噬菌体,35,S,标记蛋白质,32,P,标记 DNA,返回,35,S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞,32,P 标记 DNA,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞,3、,华生和克里克提出,DNA 双螺旋模型,。,DNA 双螺旋模型说明 DNA 分子能 够充当遗传的物质基础。,按照双螺旋模型，在细胞分裂时，DNA 的合成应是“,半保留复制,”的模式。,Watson&Crick,是生命科学研究历程中的一个具有,划时代意义的突破,。,它开辟了生命科学研究的新纪元。,It was drawn by Crick wife，which was published as the sole figure in this paper.,(美国)(英国),双螺旋模型的提出,Watson&Crick,their model of DNA double helix,双螺旋模型的提出,精美的金属双螺旋模型，高1.83米,their model of DNA double helix,双螺旋模型的提出,Mona Lisa,No molecule in the history of science has reached the iconic status of the double helix of DNA.,双螺旋模型的提出,分子生物学的新时代,就此开始了！,双螺旋模型的提出,2003年4月24日，,Nature,杂志发表了纪念文章,Double helix at 50,双螺旋模型的提出,DNA双螺旋模型,返回,美国政府决定于,1990年,正式启动HGP，预计用,15 年,时间，投入,30 亿美元,，完成 HGP。,2000.6.26,完成并公布,人类基因组工作草图。,2001 年2月16日,人类基因组计划（HGP）完成,下图,半保留复制,返回,证实半保留复制的实验,细菌培养在含,15,N,的培养基 中,细菌培养在含,14,N,的培养基中,一代,两代,4、DNA作为遗传物质的功能,（1）,贮藏,遗传信息的功能,（2）,传递,遗传信息的功能,（3）,表达,遗传信息的功能,由此，克里克提出,中心法则,确定遗传信息由 DNA 通过 RNA 流向蛋白质的普遍规律。,DNA DNA,RNA,蛋白质,中 心 法 则,遗传信息储存在核酸中,遗传信息由核酸流向蛋白质,返回,5、基因理论中的许多复杂情况,以孟德尔学说为开端的遗传理论，发展到以 DNA 分子结构为基础的,分子遗传学,，使我们对遗传规律有了确切的理解。,应该看到，,实际上生命世界的遗传现象远比上面谈到的要复杂得多。,一个基因一个性状？,不一定。例如肤色的控制至少有三个基因参与。,基因决定性状，环境还起不起作用？,在基因型确定的基础上,环境常常会影响表型。,遗传,和,变异,是遗传学的重要内容。,子代,总是与,亲代,相像，,又有一些不像。,返回,人的肤色至少由三个基因控制,返回,产生黑色素的酶在较 高温度下失活，所以毛色在端点位置呈黑色,环境影响表型,基因工程技术和应用,1、基因工程技术,基因工程是生物技术的核心部分。,基因工程的,操作,可以简述如下：,基因工程的操作流程,返回,将,外源基因,（又称目的基因，是一段 DNA 片断）组合到,载体 DNA,分子中去，再把它,转到,受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中,增值和表达,，从而得到期望的由这个外源基因所编码的,蛋白质,。,所以，基因工程的操作包含以下步骤：,获得目的基因,构造重组 DNA 分子,转化或转染,表达,蛋白质产物的分离纯化,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,总体技术路线,内切酶:DNA分子的”手术刀”,连接酶:DNA片断的”缝衣针”,载体:DNA分子的”交通工具”,到哪里去找目的基因？,一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因，称为,基因文库,。文库中基因总数 就人来说约有 3 万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为,印迹法,。,（1）获得目的基因,细胞内总DNA的提取与分离,基因文库的构建,紫外分光光度计测定DNA的纯度,反转录人工互补DNA,返回,印 迹 法,内切酶切开DNA,电泳,印迹转移,放射性探针,杂交,胶片显影,印迹法的主要步骤：,（1）基因文库 DNA 用,限制性内切 酶,处理。,（2）DNA 片断混合物通过,电泳,分离。（3）电泳后，通过,印迹,技术转到酯酰 纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA 作为,探针,，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA 片断已用放射性元素 标记，使胶片,感光,后可看出。,印迹法的关键是“,分子杂交,”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去,寻找,（“钓”）大的未知的基因片断。,探针 DNA 片断从何而来？,根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中 N端 1520 个氨基酸序列，按三联密码转为 40-60 核苷酸序列，人工合成，即为,探针 DNA 片断,。,（2）目的基因的扩增,用上面的方法“,钓,”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为,基因克隆,。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。,克隆,生物分子，,细胞，,生物个体,的无性增殖过程都称为,克隆,。,返回,（3）,PCR,把,寻找目的基因,和,扩增目的基因,两步操作并成一步。,PCR 法,，又称,多聚酶链式反应,，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。,P C R,操作流程,90,0,C,50,0,C,70,0,C,返回,PCR 反应分三步完成：,第一步,90,0,C 高温下，使混合物的DNA 片断因,变性,而成单链。,第二步,50,0,C 温度下，引物 DNA结合在适于,配对,的DNA片断上。,第三步,70,0,C 温度下，由合成酶（DNA 高温聚合酶）催化，从引物开始,合成,目的基因 DNA。,PCR 的三个步骤为一次循环，约需510 分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过 20 次循环，即可扩增,10,6,倍，总共只需,几个小时,。,（4）构造重组 DNA 分子,首先要有,载体,。载体有好几种，常用的有：,质粒,环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。,噬菌体DNA,线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。,返回,用,质粒,构建重组DNA分子,返回,用,噬菌体DNA,构建重组DNA分子,其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要好几种工具酶，其中关键的酶叫,限制性内切酶,此酶识别一定碱基序列，有的还可切出,“粘性”末端,，使得目的基因和载体的连接非常容易。,图一,图二,下图,限制性内切酶,识别,特定的,碱基序列,返回,限制性内切酶造成,粘性末端,有利于,重组DNA 分子的构建,（5）转化/转染表达蛋白质分离,把构造好的重组 DNA 分子送进,寄主细胞,，亦需要适当的,技术方法,。若受体细胞是细菌，通常称,转化,；若受体细胞是 动/植 物细胞，通常称,转染,。,基因枪法,手提基因枪,高压气体基因枪,重组 DNA 分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。,表达,通常是指目的基因编码的蛋白质合成,。,基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白质,分离纯化,，得到蛋白质产品。,大肠杆菌,SS蛋白,重组体,+,SS基因,安玛西亚快速蛋白纯化仪（FPLC,）,返回,生产基因工程产品的,生物反应器,2、基因工程的应用,基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。,（1）在医学上的应用,基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的,蛋白质肽类药物,。,胰岛素,1000 磅牛胰 10 克胰岛素,200 升发酵液 10 克胰岛素,干扰素,1200 升人血 1 升发酵液,23 万美元/病人 200300 美元/病人,返回,（2）用于提高奶酪产量,生产奶酪的,凝乳酶,传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用,酵母生产凝乳酶,，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛,凝乳酶基因,胃 转入,啤酒酵母,凝乳酶 凝乳酶,制造奶酪,返回,（3）转基因动物和植物,转基因动物首先在,小鼠,获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛/羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为“,乳腺反应器,”工程。,转基因植物,亦已在大田中广为播种。,转基因植物获得新的性状,返回,发光树,插入了萤火虫荧光素酶基因的烟草,由于荧光素酶基因的表达使得烟草发光,返回,把大鼠,生长因子,转入小鼠,得到巨大型的,转基因小鼠,。,（,4）,工程菌,在环境工程中应用,美国 GE 公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,下图,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,返回,转基因产品的安全性及其评价,哈哈，,下,课,了,!,