基因工程-克隆载体09.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,载体的概念,载体应具有的特性,载体的类型,目录,目的外源基因分离后，是,无法自主进入,到宿主细胞并进行复制表达的，必须有一个运载工具将其运达宿主细胞，才能达到复制、扩增和表达的目的,载体的概念,将外源目的基因,带入,宿主细胞并能与其一起复制、表达的,基因运载工具,就叫做基因载体或基因工程载体,基因操作的核心工具,载体应具有的特性,在受体细胞中可以,独立地进行自我复制,。因此，载体本身必须是一个复制单位即复制子（,replicon,），,具有,复制起始点,，而且插入外源基因后不会影响载体自身的复制能力。,能够带动一定长度的外源基因,一起复制,易于引入宿主细胞,载体的,分子量要小,：降低对转化率的影响；利于容纳较大的外源基因；拷贝高；易于分离；减少了不必要酶切位点,在细胞中,稳定性高,易于从宿主细胞中分离、纯化和鉴定,质粒本身必须是,安全的,最好具有,广泛的宿主适应性、核酸序列背景清楚,按其来源和本质可分为以下7种：,质粒载体,(plasmid),噬菌体载体,COS,质粒,（,cosmid,）。,也叫粘粒载体。是质粒与,的组合,噬菌粒载体,（,phagemid,）,是质粒与,f,1,的组合,病毒载体,DNA,病毒为主,人工染色体载体,穿梭载体,（,shuttle,）,载体的类型,按功能区分：,克隆载体：也叫转移载体，只起转运，扩增作用,表达载体：带有表达功能，即有启动子，可转录和,/,或翻译,测序载体：只产生,单链,DNA,用于测序，如,M13,、,T,载体、,U,载体,转录及调控载体,按照所需宿主细胞的类型分：,真核（表达）载体,原核（表达）载体,穿梭载体,质粒载体,Plasmid,质 粒,定义：独立于染色体的,自主复制,的DNA物质。编码非染色体控制的遗传性状,特 性,1、复制通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的,复制起始区,（整个遗传单位定义为复制子）,复制子(Replicon)：Genome能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个,复制起点,2、拷贝数,严紧型（stringent plasmid）:低拷贝,松弛型（ralaxed plasmid）：高拷贝,质粒,复制子,拷贝数,pBR322 及其衍生质粒,pMB1,1520,pUC 系列质粒及其衍生质粒,突变的 pMB1,500700,pACYC 及其衍生质粒,p15A,10212,pSC101 及其衍生质粒,pSC101,5,ColE1,ColE1,1520,3质粒的不相容性,（plasmid incompatibility）,两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性。不相容的质粒一般都,利用同一复制系统,4、生物学特性（分子标记）质粒可以赋于宿主细胞不同的,表型,，如,抗药性,、结合转移特性、产肠毒素或溶血素等,质粒表型的表示法：F,+,/F,-,、Amp,r,/Amp,s,、Tet,r,/Tet,s,、Amp,r,/,Tet,s,、Kan,r,、Str,r,、Cml,r,、Neo,r,5、质粒的转移和丢失（清除）,带有一个,tra基因,，可以自主地在宿主细胞间通过控制细菌配对和结合而发生转移的质粒叫,接合型（conjugative）质粒，又叫自我转移性质粒。,无此基因而无此功能者叫,非接合型或非自我转移性质粒,（no-conjugative plasmid）,非自我转移性质粒：R质粒、Col质粒,自我转移性质粒：F质粒及Ent质粒（,可产生肠毒素,）,基因工程中由于使用非接合型质粒，因此质粒的,转移需人工条件,，一般是用化学（氯化钙）、物理（电击）或其它方法（脂质体）改变细胞膜通透性，使质粒DNA进入细胞，该过程叫,转化,质粒在自然条件下可从宿主菌中消失，或在人工条件下消失，这叫,质粒的消除，俗称丢失,。基因工程中质粒，特别是重组质粒的丢失是非常不幸的事,可促使质粒丢失的因素：,吖啶橙、结晶紫、溴化乙锭、利福平、SDS、紫外线,等,质粒载体的概念,质粒载体是以细菌天然质粒的各种组件为基础，经,人工改造、构建,而成的特殊质粒,外源基因的载体，是基因工程的工具,质粒的基本条件,1、复制起点：自我增殖，一个或两个（shuttle）,2、,标记基因,选择,标记基因：用于鉴别目标 DNA（载体）的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来,筛选,标记基因：用于将特殊表型的重组子挑选出来,标记基因,选择标记,氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene,Amp,r,）,四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,Tet,r,）,氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene,Cm,r,cat,）,卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycin resistance gene,kan,r,neo,r,）,蔗糖致死基因,SacB,：含蔗糖的培养基上,sacB,基因的表达对大肠杆菌来说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子,筛选标记,1.,-互补,（-complementation）,-互补是指,lacZ,基因上缺失,近操纵基因区段,的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶（,-galactosidase,，由 1024 个氨基酸组成）突变体之间实现互补,2.插入失活,3.GFP,筛选标记,2.插入失活,3.GFP,质粒的基本条件,3、若干限制酶,单一,识别位点,4、小的分子量、高的拷贝数,常用质粒载体,克隆载体克隆载体主要用于扩增或保存 DNA 片段,pBR322系列,pUC系列,pUC18/19,pGEM系列：多功能质粒载体是由pUC质粒改建而来。在多克隆位点两侧多了两个来自不同噬菌体的启动子，即T7和SP6,启动子,，可用于克隆、表达、转录及测序等。,质粒载体的受体细胞,基因工程中使用的菌株叫做工程菌，都是经过,人工筛选、改造,的菌株,受体菌的,人工改造,是接受外源DNA和阳性转化子筛选的基础，改造重点：R,（限制阴性）、M,（修饰阴性）、red,（重组缺陷型，即不能与外DNA发生重组）及抗性，与载体的表型互补（LacZ,M15）,（1）DH,5,具有互补作用，适用于多种质粒载体,（2）HB101 无互补作用,（3）JM系列 具有互补作用,噬菌体载体,噬菌体载体,双链DNA噬菌体载体,单链DNA噬菌体载体,双链,DNA,噬菌体载体,噬菌体是一种双链DNA病毒，大小约,48,502bp,，在噬菌体颗粒中它是以线状形式存在，,线状,分子的两端有一个12个核苷酸的、5-端突起的、可互补的粘性末端（Cohesive end site,COS,）。当侵入宿主细胞后，线状DNA分子借助粘性末端连结成,环状,分子,野生型噬菌体基因组DNA 的MW为48Kb,所以包装上限：105%48Kb=51Kb,必须区段28 Kb,，所以克隆能力为51-28=,23,Kb,噬菌体作为载体的优点：a.可容纳较大的外源DNA片段b.具有较高的,感染效率,c.由于能裂解宿主细胞，容易提取载体DNA或重组DNA,d.用载体组建的DNA或cDNA文库易于长期保存,柯斯质粒载体,粘粒载体，由Collins和Hohn于1978年构建,Cos,mid,:,cos,site-carry plas,mid,带有粘性末端位点的质粒,。是人工构建的含有,DNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,特点：,具有质粒和噬菌体载体的,双重特点,可以插入较大的外源基因（,3145kb,）,柯斯质粒载体,质粒复制子、MCS、选择标记,cos位点及包装序列（,末端酶,，能识别两个相距适宜的cos位点），体外包装，高效转染，但不产生子代,单链噬菌体载体,单链噬菌体包括,M13、f1、fd,，均为丝状，亲缘关系密切，长度均为6.4kb，单链环状正股DNA分子,优点：,胞内为双链，胞外为单链。,复制型,为双链环状DNA，可按细菌质粒使用。,单链可用作测序、制备探针、定点诱变,。无论双、单链，均不需包装即可感染大肠杆菌，体内包装不受DNA分子大小限制,噬菌粒,（phagemid,phasmid）,质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的载体,优点：分子量小（3.0Kb）、克隆能力大（10Kb）、稳定遗传以及,用来制备单链或双链DNA,（有辅助病毒存在时，载体就以噬菌体的模式增殖，产生单链DNA。若无,辅助,病毒存在，则以质粒的形式复制，产生双链DNA）等,pEMBL(f,1,与pUC8组成),pBluescript,(f,1,与pBR322组成)。,pGEM-T Easy,(3kb)，俗称“T载体”（pGEM与f,1,组成）,pUC118/119,(M13与pUC18组成),噬菌体的受体菌,噬菌体的常用宿主菌均为大肠杆菌，但不同性质的载体应选择不同,遗传标记,的菌株。应查有关资料,M13最常用的宿主菌为JM系列（JM101110）,酵母人工染色体,(YAC),真正的人工染色体要在寄主细胞中稳定地复制并遗传下去,必须具备三个元件:,复制起始区,(origin of replication),参与染色体DNA 复制起始结构的形成;,着丝粒,(centromere),负责染色体向子细胞的传递;,端粒,(telomere),对染色体DNA 两个末端,起封口和保护作用,YAC 能容载长达9001000kb片段。,缺点:,1)存在,嵌合,现象(chimerism),即一个YAC克隆中的插入子可能来自两个或多个不同的片段,嵌合体的比例达到10%50%,这种现象使染色体步行(chromosome walking)和基因分离难度加大;,2),稳定性差,插入片段存在重排和丢失现象;,3)插入片段的,分离和纯化困难,;,4),转化效率低,。,细菌人工染色体,(BAC),BAC载体系统是在大肠杆菌F 因子的基础上发展而来的,F 因子具有稳定遗传的特点,其复制是严紧型的,在每个细胞中仅有12 个拷贝,减小了插入片段发生重组的机率,容载能力一般为100350kb,1)以大肠杆菌为寄主,转化率高,构建更容易;,2)BAC 载体以环型超螺旋状态存在,从大肠杆菌中提取较方便,3)BAC 的复制子来源于F 因子,可,稳定遗传,嵌合及重组现象少,4)克隆位点的两侧具有T7 和Sp6 聚合酶启动子,可以用于转录获得RNA 探针或直接用于插入片段的末端测序,优点,源于,P1,的人工染色体,(PAC),PAC 载体以F 因子和噬菌体P1 为基础构建,兼有二者的特点,通过电转化可将PAC 导入大肠杆菌。,特点：PAC 载体可以插入约300kb 的外源片段,插入的外源DNA 没有明显的嵌合和缺失现象,可以稳定遗传及高效扩增。,双元细菌人工染色体(binary BAC,BIBAC)和可转化人工染色体(transformation-competent artificial Chromosome,TAC),这些载体不仅具有较大的克隆容量,而且具备了直接,转化植物,进行功能互补实验的功能。,穿梭功能,结合BAC 载体和Ti 质粒的特点,表达载体,1、基本成分,复制起点,筛选基因,MCS,参与控制转录与转译的遗传元件,启动子、转录终止子,转译起始序列、转译增强子、转译终止子,病毒载体,动物病毒载体的特点,1、真核表达问题：基因表达,2、自主感染、整合：转基因,3、基因治疗,4、重组疫苗：无毒、多价、多联,5、种类繁多，优势突出,动物病毒载体的种类,1、昆虫病毒载体,2、哺乳动物病毒载体,昆虫病毒载体,多角体病毒（杆状病毒）载体（NPV载体）-转移载体。,杆状病毒为环状dsDNA,(30kb),其包涵体称为,多角体,苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)-,秋粘虫,家蚕核多角体病毒(BmNPV)-,家蚕,棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)-,棉铃虫,baculovirus expression vector system,BEVS),Sf9细胞,特 点,属于真核表达体系,基因组大，容量大（10kb）,安全,：不感染脊椎动物，其启动子在哺乳动物细胞中无活性,产量高,：使用的是,晚期启动子,，故外源产物对表达系统无影响，多角体蛋白启动子和p10启动子为强启动子,可在昆虫细胞培养物和虫体内表达,多角体蛋白基因和p10基因,为非必需区，可供插入外源基因，重组病毒因,插入失活,不形成多角体，提供选择标记，且不能形成包涵体，因而不能像野生型病毒那样在外界存活,哺乳动物病毒载体,应用最多的是双股线状DNA病毒，如,痘病毒、疱疹病毒、腺病毒,等，另外，还有环状双链DNA的,SV40病毒,以及,反转录病毒,SV40病毒,环形双链的DNA，分子质量较小；它是第一个完成基因组DNA全序列分析的动物病毒；包装范围相当严格；寄主细胞的局限性,1.晚期区段取代型载体,外源DNA取代晚期DNA,辅助病毒,一、取代型,2.早期区段取代型载体,外源DNA取代SV40 DNA的早期区,通过构建能持久表达病毒T抗原的特殊细胞系，能够互补早期区段取代载体丧失的合成T抗原的功能。细胞系：,COS细胞系,（SV40早期区段DNA，转化正常的猿猴受纳细胞CV-1而得到的。故特称为COS(CV-l，origin,SV40)细胞系,HFS(human fibroblasts，SV40）,能够组成地表达T抗原,二、重组的病毒-质粒载体,1.由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做,病毒-质粒载体(viral-plasmid vector),只含有SV40复制起点的DNA片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viral replicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒-质粒载体，称为微型病毒复制子-质粒载体,2.微型病毒复制子-质粒载体,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒的基因组DNA,线性双链DNA，长约36Kb，两端各有一个反向末端重复区（inverted terminal repeat ITR），ITR内侧为病毒包装信号,为病毒复制必需区。病毒基因组可分为编码区和非编码区。编码区又可分为早期转录区和晚期转录区，,E1-E4,为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，,L1-L5,为编码病毒包装蛋白的晚期基因,。非编码区含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。除E3 区外，其余的编码区及顺式作用元件均为病毒复制所必需,去除腺病毒基因组的E1和（或）E3 两个区而获得，其复制必须在由5型腺病毒转化的可组成性表达E1蛋白的,293 细胞,中完成。但由于病毒载体与表达E1 蛋白的293 细胞之间存在同源序列。在293 细胞中繁殖时，通过重组，可重新获得E1 区，出现复制型腺病毒(Replication competent,Adenovirus,，RCAs),仍能进行病毒DNA 的复制、晚期结构蛋白的合成和可复制腺病毒的产生，激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫，使载体在体内的持续时间以及再次应用受到极大影响,第一代腺病毒载体,第二代腺病毒载体,在E1、E3缺失的基础上进一步去除了E2区和(或)E4区,减弱病毒蛋白的表达,宿主的免疫反应仍然是获得转基因长期表达和重复使用腺病毒载体的主要障碍,第三代腺病毒载体,去除了病毒载体中所有的编码基因,只保留其复制和包装必需的顺式作用元件，这种载体可避免RCAs 的产生,大大降低宿主对病毒的细胞免疫反应,利于载体的长期应用,而且可使腺病毒载体的克隆容量接近37kb,其它功能由辅助病毒提供,空壳载体,腺病毒载体的优点,稳定性强,病毒基因组重排频率低,安全性较好,无需整合,基因毒性低;,插入片段大,宿主范围广,靶向性,国家一类新药,世界上第1个溶瘤药物,基因治疗，安全性高，无器官毒性。,常用的病毒载体的特点：,选用载体的原则,（1）根据,研究目的,选择载体种类，如克隆载体、表达载体（原核表达载体、真核表达载体）、测序载体等。,（2）根据,酶切位点,是否好用选择载体,（3）根据,外源基因的大小,选择载体,(4)根据所要使用的,宿主细胞种类,选用载体。,