核酸分子杂交(研究生课程)课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第,4,章 核酸分子杂交,研究生课程,Nucleic Acid hybridyzation,朱名安 教授,内容提要,第,二,节,核酸探针（Probe）,第,三,节,杂交类别与应用,第一节 分子杂交,概念与基本原理,第一节 分子杂交,概念与基本原理,Concept,&,Principle of,Molecular Hybridization,单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称,核酸分子杂交（molecular hybridization）,一、分子杂交,概念,变性,复性,DNA-DNA,杂交双链分子,二,、分子杂交,基本原理,变性,复性,2,、变性的方法,（,1,）热变性：温度升高到,90100,时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。,（,2,）酸碱变性：,pH,值低于,3,或高于,10,时，双链核酸分子链间的氢键断裂。,（,3,）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛纯水等使双链核酸分子链间的氢键断裂。,3、DNA变性曲线,AT区先解链,GC区后解链,阶梯式曲线,DNA,变性的,基本,过程,（,G+C,）,%=,（,Tm-69.3)2.44,Tm=(G+C)%0.41+69.3,4,、,GC,含量与,Tm,值之间的关系,定义：,变性的单链核酸分子在一定条件下,按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，,称复性或杂交。,具,有互补序列两条单链都可形成双链：,DNA/DNA,、,RNA/DNA,、,RNA/RNA,、寡核苷酸,/DNA,和寡核苷酸,/RNA,。,（二）DNA复性,（,renaturation,）,复性过程,（,1）单链分子间碰撞形成局部双链,（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离,（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列,（4）形成完整的双链分子,三,、,影响杂交（复性）的因素,1、核酸分子的浓度和长度,浓度越大，复性速度越快,分子越大，复性速度越慢,单链探针，浓度增加，杂交效率增加,双链探针，浓度控制在0.1,0.5g,/ml,浓度过高影响杂交效率,2、温,度,（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20,25,（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值,（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,3,、离子强度,（,1,）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增,加，杂交率增加,（,2,）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，,当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必,须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液,的盐浓度,4、甲酰胺,（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低,杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更,稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%,甲酰胺溶液在35,42杂交,；,（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则,用水溶液在68杂交,。,5、核酸分子的复杂性,（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中,不同序,列的总长度,（,）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性,后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,6、非特异性杂交反应,（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少,其对探针的非特异性吸附,（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA,和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，,Denharts溶液或脱脂奶粉,第,二,节,核酸探针（Probe）,1,、什么是探针,(probe),一小段用,同位素,、,生物素,或,荧光染料标记,其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,一,、探针,概念,DNA,探针,是最常用的核酸探针，长度在几百,bp,以上的双链或单链,cDNA,片段（,通常,400500bp,）,放射性或非放射性标记的,RNA,分子，用于探测与之互补的,DNA,或,RNA,链，,RNA,探针通常通过克隆相应,DNA,在体外转录合成而制备,（通常,400500bp,）,RNA,探针,寡核苷酸,探针,一般有,17-50,个核苷酸组成，可以是寡聚脱氧核醣核酸、寡聚核糖核酸和肽核酸,二,、探针,种类,理想标记物应具备的特性,高度灵敏性,不影响碱基配对的特异性,不影响探针分子的主要理化性质,对酶促反应活性无影响或影响不大,检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,三,、探针,标记物,核素标记物：,32p,、,35s,、,3H,非核素标记物,半抗原：生物素、地高率,配体：生物素是亲和素的配体,荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等,化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光。,标记物种类,四,、探针,标记方法,随机引物标记,DNA,缺口平移标记,全程,RNA,探针标记,化学法全程标记,3,末端标记,5,末端标记,随机引物标记,最常用,DNA,模板,引物和模板,DNA,结合,加入,klenow,片断、,3,种,dNTP,和,1,种标记,dNTP,引物延伸,标记的,DNA,片段,未标记的,DNA,模板,DNase,DNA,聚合酶,（,5,3,核酸外切酶活性,5,3,聚合酶活性）,3dNTP,1dNTP#,DNaseDNA,聚合酶,（,5,3,核酸外切酶活性,5,3,聚合酶活性,）,模板,DNA,切开模板,DNA,形成一到几个碱基的缺口,掺入标记基团,缺口平移,DNA,缺口平移标记,在处酶切,在处酶切,从,T7,启动子转录,从,SP6,启动子转录,全程,RNA,探针标记,一、设计原理,化学法全程标记,(,生物素或地高辛标记,),与地高辛标记的探针杂交,加入与碱性磷酸酶结合的,抗地高辛抗体,加入,底物,BCIP/NBT,CSPD,一、设计原理,末端标记,3-,末端标记,5,3,3,5,5,末端突出的,DNA,5,5,3,3,3,末端标记的,DNA,完整双链,DNA,KlenowDNA,聚合酶,32,pdNTP,变性,32p,末端标记的,单链,DNA,探针,一、设计原理,末端标记,5-,末端标记,乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀,DNA,片段，可去除,dNTP,和蛋白质,凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子,DNA,和小分子,dNTP,、磷酸根离子及寡核苷酸（,80bp),等物质分离，常用凝胶基质是,Sephadex G-50,微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针。,五,、探针,的纯化,第,三,节,杂交类别与应用,三种印迹技术的比较,（一）液相杂交,（二）固相杂交,（三）原位杂交,（四）基因芯片技术,点杂交,/,狭缝杂交,菌落杂交,Northern,杂交,Southern,杂交,反点向杂交,一、,MASA液态芯片,二、,杂交的基本分类,MASA,是一种在悬浮液态体系中进行的生物分子间反应，并以100种不同荧光编码的微球作为探针的一类新型生物芯片技术。它集合了流式细胞技术、数字信号处理技术、激光技术及传统化学技术为一体，是一种新型生物分子检测技术。其反应体系中可以进行大分子蛋白、小分子蛋白、核酸等生物的检测,。,MASA,技术的原理,是用不同的荧光颜色对乳胶颗粒进行编码使之具有检测多个靶分子的能力,二、,杂交的基本分类,概念：,反向点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等提出的一种斑点杂交技术，是将探针固定在玻璃芯片或尼龙膜上，用于检测扩增产物中是否含有目标基因的技术。,二,、,反点向杂交,原理与应用：,RDB是先将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(一般是经PCR特异性扩增的产物，在PCR引物5端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交,；,待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。,一次就可以判断某一基因座位的大部分或全部等位基因，因此利用这样的工作原理还可以用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。,2.Southern blot,3.Northern blot,4.,点杂交和狭缝杂交,5.,荧光原位杂交,6.,基因芯片,1.,菌落杂交,三,、,固向杂交,1.,菌落杂交,分子杂交实验,2.Southern blot,2.Southern blot,DNA,片段在琼脂糖凝胶上电泳分离,膜上固定,DNA,片段,在缓冲液中将标记的探针加到膜上,DNA,片段从琼脂糖凝胶上转印到膜上,杂交信号的检测,2.Southern blot,1,、裂解或破碎细胞,2,、抽取纯化基因组,DNA,3,、限制酶消化,DNA,为大小不同的,DNA,片段,待测核酸样品的制备,1、琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶,，,分离小片段用高浓度胶,2、凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小 相同的分子处于同一条带,3、分子量标准：经Hind消化的DNA，杂交所用分子量标准可用核素标记,待测,DNA,样品的电泳分离,凝胶中核酸的变性（碱变化）,凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液。,Southern,印迹,指将电泳分离的,DNA,片段转移到一定的固,相支持物上的过程,固相支持物的选择,（,1,）理想的固相支持物应具备的特性,具有较强结合核酸分子的能力,不影响与探针的杂交反应,与核酸分子结合稳定牢固,具有良好的机械性能,非特异吸附少,（,2,）常用的固相支持物,硝酸纤维素膜：,优点是吸附能力强，杂交信号本,底低。缺点是,DNA,分子结合不牢固,尼龙膜,：优点是结合单链，双链,DNA,的能力比硝酸,纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高,化学活化膜：,优点：,DNA,与膜共价结合；对不同,大小的,DNA,片段有同等结合能力；缺点：结合能,力较上述两种膜低,Southern,印迹的常用方法,（,1,）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的,DNA,转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的,NaCl,和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的,DNA,片段垂直向上运动，凝胶中的,DNA,片段移出凝胶而滞留在膜上,（,2,）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,（,3,）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,Southern杂交,1、预杂交：,封闭膜上能与DNA结合的位点,预杂交液为不含DNA探针的杂交液,2、杂交：,液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交,双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交,3、洗膜：,去除游离的放射性探针或非特异结合的,DNA,杂交结果检测,1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针,2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,Southern,杂交在医学中的应用,1,、酶切图谱分析,2,、特定基因定性和定量,3,、基因突变分析,4,、限制性片段长度多态性的分析,1、基本原理和基本过程与Southern blot,基本相同,2、鉴别RNA,3、探针可用DNA或RNA片段,4、待测样品为总RNA或mRNA,3.Northern,印迹杂交,Northern印迹与Southern 印迹的不同点,1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保 持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性,2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern 印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理,3、靶核酸为RNA,4.,点杂交和狭缝杂交,DNA,样品点到滤膜上,1,变性,2,中和,3,固定,DNA,4,与标记探针杂交,5,洗脱与显影,探针,DNA,探针标记,变性,将探针加到固定的,DNA,上,1、斑点印迹为圆形,2、狭缝印迹为线状,3、鉴别DNA、RNA,4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品,5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,1,）定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：,DNA/DNA,、,RNA/DNA,、,RNA/RNA,杂交。,5.,原位杂交,保持组织细胞的形态,对核酸无抽提，修饰与降解作用,不改变核酸在组织细胞内的定位,不阻碍核酸与探针的杂交过程,对杂交信号无遮蔽作用,理化性质稳定,2,）,杂交过程,（1）组织或细胞的固定,，,理想固定液应具备：,（,2,）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如,Triton x-100,和,SDS,）和蛋白酶,K,去除核酸表面的蛋白质,组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体,控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落,（,3,）探针的选择与标记,以获得最好杂交效果为依据选择探针,探针的长度一般为,50,300bp,有时达,1.5kb,放射性核素标记探针敏感性高，操作简便稳定检测结果分辨率高，但信号检测时间长,非核素标记探针安全、稳定性好、显色快，易于观察,（,4,）杂交,杂交液体积小：,10,20l,cDNA,和,RNA,探针杂交温度约为,50,杂交时间,:DNA,探针杂交为,2,4h.RNA,探针杂交过夜,杂交前一般将组织切片置,95 515,分钟使,DNA,变性,冲洗温度一,般不,超过,50,（,5,）杂交结果检测,所用探针为核素标记,放射自显影检测,所用探针为非核素标记,显色,或化学发光检测,放射自显影照片,杂交显色图片,荧光原位杂交,荧光原位杂交,FISH,技术是一种非放射性分子遗传学实验技术，其基本原理是将直接与荧光素结合的寡聚核苷酸探针或采用间接法用生物素、地高辛等标记的寡聚核苷酸探针与变性后的染色体、细胞或组织中的核酸按照碱基互补配对原则进行杂交，经变性,退火,复性,洗涤后即可形成靶,DNA,与核酸探针的杂交体，直接检测或通过免疫荧光系统检测，最后在荧光显微镜下显影，即可对待测,DNA,进行定性、定量或相对定位分析。,荧光原位杂交,FISH,技术有以下几点优势：安全、快速、灵敏度高；探针能较长时间保存；多色标记，简单直观；可用于中期染色体及间期细胞的分析；可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。,6.,基因芯片,6.,基因芯片,采用原位合成（,in situ synthesis,）或显微打印手段，将数以万计的,DNA,探针固化于支持物表面上，产生二维,DNA,探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断。,1.何谓分子杂交?,其,原理是什么？杂交的影响因素有哪些？,2.,常见的分子杂交的种类有哪些，,其应用,什么?,3,.何谓探针,，标记方法有哪些？,思考题,