《DNA重组技术的基本工具》(选修3)课件.ppt

专题,1,基因工程,题图：,科技探索之路：,1.1 DNA,重组技术的基本工具,1.2,基因工程的基本操作程序,1.3,基因工程的应用,1.4,蛋白质工程的崛起,选修,3,：,现代生物科技专题,专题,1,基因工程,专题,1,基因工程,DNA,重组技术的基本工具,基因工程的基本操作程序,基因工程应用,蛋白质工程的崛起,烟草,据,WTO,调查：,2004,年全世界因狂犬病致死人数约,5.5,万人,中国卫生部通报：,2004,年,月，狂犬病列法定报告传染病死亡数之首。,发病死亡率近,100%,能产生狂犬病抗体蛋白的转基因,每,100kg,猪或牛的胰腺中仅可提取,45g,。,1979,年，美国将,人的胰岛素基因,重组到,大肠杆菌,内，实现了细菌生产胰岛素，大大降低了生产成本。,治疗糖尿病特效药,据,WTO,调查：,2005,年全世界约有糖尿病患者,1.8,亿人，我国约,6000,万。,胰岛素,思考,Q,：,转基因技术,实现了,一种生物,的某些,性状,在,另一种生物,中,表达,。,这些性状的表达与我,们学过的基因的什么过程有关？,密码子在生物界是的！,DNA(,基因,),mRNA,蛋白质,(,性状,),转录,翻译,通用,基因工程：又叫,DNA,重组技术,。通俗的说，就是,按照人们的意愿,，把,一种生物,的,某种基因,提取出来，加以修饰改造，然后放到,另一种生物的细胞里,，定向地改造生物的遗传特性。,基因工程的概念,沃森,、,克里克,提出,DNA,的,双螺旋结构,模型。,科技探索之路,20,世纪中叶,基础理论,取得了重大突破,梅塞尔松,、,斯塔尔,证明,DNA,的,半保留复制,科技探索之路,20,世纪中叶,基础理论,取得了重大突破,克里克,等提出,中心法则,DNA,RNA,蛋白质,转录,翻译,逆转录,复制,科技探索之路,20,世纪中叶,基础理论,取得了重大突破,科技探索之路,1963,年,尼伦伯格,和,马太,破译,编码氨基酸的,遗传密码,，,1966,年,霍拉纳,用实验加以证明。,20,世纪中叶,基础理论,取得了重大突破,技术发明使基因工程的实施成为可能,1),基因转移载体的发现,2),工具酶的发现,3)DNA,合成和测序技术的发明,4)DNA,体外重组的实现,5),重组,DNA,表达实验的成功,6),第一例转基因动物问世,7)PCR,技术的发明,科技探索之路,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,主要的技术,结果,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA,分子水平,人类需要的新生物类型和产品,剪切,拼接,导入,表达,一、基因工程的原理,DNA,重组技术或转基因技术,问题探讨：,苏云金芽孢杆菌含有一种可以,合成毒蛋白的基因。,让细菌的毒蛋白基因在棉花细,胞中表达，可培育出抵抗棉铃,虫害的抗虫棉。,想一想：,需要做哪些关键工作？,苏云金芽孢杆菌,毒蛋白,普通棉花抗虫棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,在以上过程中,关键步骤或难点,是什么？,普通棉花,(,无,抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,通过运载体导入,转基因棉花,含,抗虫基因,转基因棉花产生,伴胞晶体,转基因棉花,有,抗虫特性,二、,DNA,重组技术的基本工具,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内,提取出来,关键步骤二：,抗虫基因,与棉花,DNA“,缝合”,关键步骤三：,抗虫基因,进入棉花细胞,二、,DNA,重组技术的基本工具,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,“分子手术刀”,限制性核酸内切酶,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来,关键步骤二：,抗虫基因与棉花,DNA“,缝合”,关键步骤三：,抗虫基因进入棉花细胞,“分子缝合针”,DNA,连接酶,“分子运输车”,基因进入受体细胞的,载体,二、,DNA,重组技术的基本工具,思考,Q:,1.,在自然界中有一些生物的,DNA,可能,进入另一种生物的细胞中。我们有没有学过相,关的实例？,2.,单细胞生物并没有在进化中，为什么不会因外,源,DNA,的入侵而灭绝？有何保护机制？,可能产生了一些特殊的酶来防范。可能这种酶能识别外来侵入的,DNA,并将其分解，而对自身的,DNA,不能起作用。,“分子手术刀”,限制性核酸内切酶,寻根问底,你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？,原核生物易受自然界外源,DNA,的入侵,，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。,限制酶,就是细菌的一种,防御性工具,，当外源,DNA,侵入时，会利用限制酶,将外源,DNA,切割,掉，以保证自身的安全。所以，,限制酶在原核生物中主要起到切割外源,DNA,、,使之失效,，从而达到,保护自身,的目的。,思考与探究,P7,（,2,）,为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其,DNA,分子中,或者,不具备,这种限制酶的,识别切割序列,，,或者,通过甲基化酶,将甲基转移,到所,识别序列,的碱基上，使,限制酶不能将其切开,。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的,DNA,被切断，并且可以防止外源,DNA,的入侵。,主要来源：,种类与命名：,作用特点（,特异性,）,4.,限制酶识别序列,5.,作用结果：,1.,识别双链,DNA,分子中,特定的核苷酸序列,2.,切割特定核苷酸序列中的,特定位点,主要从原核生物中分离纯化,产生黏性末端或平末端,Go on,大多数限制酶的识别序列由,6,个核苷酸组成,少数的识别序列由,4,、,5,或,8,个核苷酸组成,一、限制性核酸内切酶,-,分子手术刀,种类与命名：,现在已经从约,300,种微生物中分离出了约,4000,种,限制性内切酶,(,限制酶,),。,E,co,R,S,ma,粘质沙雷氏杆菌,（,Serratia,marcesens,）,大肠杆菌,（,Escherichia,coli,R,）,Go back,练习：流感嗜血杆菌的,d,菌株,(Haemophilus influenzae d),中先后分离到,3,种限制酶，则分别命名为,:,Hin,d,、,Hin,d,和,Hin,d,T,磷酸二酯键,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,A,G,A A,T T,C,C,T T,A A,G,C C C G G G,G,G G,C C,C,EcoR,（,4,）,作用结果：,黏性末端和平末端,Sma,EcoR,黏性末端,黏性末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,限制酶所识别的序列，无论是,6,个碱基还是,4,个碱基，都可以找到一条,中心轴线,（如图），中轴线两侧的双链,DNA,上的碱基是,反向、对称、重复,排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的,DNA,？,实例：,1,、下列关于限制酶的说法正确的是（）,A.,限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中少,B.,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,C.,不同的限制酶切割,DNA,后都会形成黏性末端,D.,限制酶的作用部位是特定核苷酸形成的氢键,Q:,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性,(,平,),末端？,要切两个切口，产生四个黏性,(,平,),末端。,Q:,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生,相同的黏性,(,平,),末端,，然后让两者的黏性,(,平,),末端,黏合,起来，就似乎可以合成重组的,DNA,分子了。,思考,?,1,、种类：,2,、作用部位：,两类,Ecoli DNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,磷酸二酯键,DNA,连接酶,可,把切下来的,DNA,片段拼接成新的,DNA,。即,:,把黏性末端,之间的缝隙,“,缝合,”起来,实质是,把,脱氧核糖和磷酸,连接起来,.,二,、,DNA连接酶,-,-,分子缝合针,类型：,类型,Ecoli,DNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,来源,功能,大肠杆菌,T,4,噬菌体,恢复,磷酸,二酯键,只能连接,黏性末端,能连接,黏性末端,和,平末端,(,效率较低,),相同点,差别,二,、,DNA连接酶,-,-,分子缝合针,可把黏性末端之间的,缝隙“缝合”,起来，,Ecoli DNA,连接酶或,T,4,DNA,连接酶,即,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,T,4,DNA,连接酶,还可把,平末端,之间的,缝隙,“缝合”,起来，但,效率较低,T,4,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,DNA,连接酶,区别,相同点,寻根问底,DNA,连接酶与,DNA,聚合酶是一回事吗,?,为什么,?,1),只能将,单个核苷酸,连接到已有的,DNA,片段上，形成磷酸二酯键,形成,磷酸二酯键,1),在,两个,DNA,片段之间,形成磷酸二酯键,Q:,外源基因,(,如抗虫基因,),怎样才能导入受体细胞,(,如棉花细胞,),？,1.,作用：,2.,种类：,质粒、,噬菌体的衍生物,和动植物病毒等。,将,外源基因,送入受体细胞。,三,、,基因进入受体细胞的载体,-,-,分子运输车”,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒,:,常含有,抗药基因,如,:,四环素的标记基因。,(,质粒的存在与否对受体细胞生存没有决定性作用，但复制,只能在,受体细胞,内,完成,),质粒是,一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（即拟核,DNA,）之外，并且具有,自我复制,能力的,双,链,环,状,DNA,分子,质粒是基因工程最常用的载体,1.,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？,2.,作为载体没有,切割位点,将怎样？,3.,目的基因,是否,进入受体细胞，你如何去察觉？,4.,如果载体对受体细胞有害将怎样？,作为运载体必须具备的条件,作为运载体必须具备的条件,1.,能够在受体细胞中,自我复制,并,稳定,地保存。,2.,具有,一个或多个限制酶切点,，以便与外源基因连接。,3.,具有某些,标记基因,，便于进行筛选。,4.,必需是安全的，不会对受体细胞有害。,注意：,真正用作运载体的质粒都是人工改造过的,质粒的特点：,1,、细菌染色体外双链环状,DNA,分子,2,、能自我复制并在受体细胞中稳定存在,3,、有一个或多个限制酶切点,4,、有特殊的遗传标记基因,注意：,真正用作运载体的质粒,都是,人工改造过的。,注意：,这两条,DNA,分子的碱基对不是随意乱写的。,一、每个,DNA,分子上的两条链上的碱基要互补配对；,二、每个,DNA,分子中每条链都存在一个,G-A-A-T-T-C,的碱基序列，也就是说是,EcoRI,限制酶的识别序列，并存在,G-A,的切割位点。,四、,模拟操作：重组DNA分子的模拟操作,小结：,基因工程,的工具,限制酶,主要存在于原核生物中,具有专一性,(,识别序列,),切开,DNA,分子的磷酸二酯键,DNA,连,接酶,连接磷酸二酯键,种类,E.coliDNA,连接酶,T,4,DNA,连接酶,运载,工具,具备的,条件,结构简单,大小适中,能在宿主细胞中自,我复制并稳定存在,具一个多个限制酶切位点,具标记基因,质粒、,噬菌体衍生物、动植物病毒,1,、关于限制酶的说法中，正确的是（）,A,、限制酶是一种酶，只识别,GAATTC,碱基序,列,B,、,EcoRI,切割的是,GA,之间的氢键,C,限制酶一般不切割自身的,DNA,分子，只,切割外源,DNA,D,限制酶只存在于原核生物中,课堂练习,2,、,DNA,连接酶催化的反应是,(),A,DNA,复制时母链与子链之间形成氢键,B,黏性末端碱基之间形成氢键,C,两个,DNA,片段黏性末端之间的缝隙的连接,D,A,、,B,、,C,都不正确,3,、作为基因的运输工具,载体，必须具备的条件及理由是,(),A,、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因,B,、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达,C,具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件,D,、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选,4,、质粒是基因工程最常见的载体，它的,主要特点是,(),能自主复制不能自主复制,结构很小是蛋白质是环状,RNA,是环状,DNA,能“友好”地“借居”,A,、,B,、,C,D,5,、在受体细胞中能检测出目的基因是因为,(),A,、目的基因上有标记,B,、质粒具有某些标记基因,C,、重组质粒能够复制,D,以上都不正确,6,、关于质粒的叙述正确的是,(),A,、质粒是能够自我复制的环状,DNA,分子,B,、质粒是唯一的载体,C,、重组质粒是目的基因,D,、质粒可在宿主外单独复制,7,、基因工程中可用作载体的是,(),质粒 噬菌体,病毒 动物细胞核,A,、,B,、,C,D,、,8,、下列关于基因工程中所选用的质粒,的说法，错误的是,(),A,、不能没有标记基因,B,、是小型链状的,DNA,分子,C,、能够自我复制,D,可与目的基因重组,9,、下列黏性末端属于同一限制酶切割而,成的是,(),A,、,B,、,C,、,D,、,10,、要使目的基因与对应的载体重组，所需的两种酶是,(),(1),限制酶,(2),连接酶,(3),解旋酶,(4),还原酶,A,、,(1)(2)(3)B,、,(1)(2)(4),C,、,(1)(2)D,、,(1)(3),