分子生物学-第一章--DNA结构.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主要参考书目：,孙乃恩等,.,分子遗传学,南京大学出版社,.1999,朱玉贤等,.,现代分子生物学,科学出版社,.2000/2004,（第二版）,/2007(,第三版,),Lewin.B.Gene,Oxford University Press,2004,重组,DNA,技术的应用,荧光鱼,产药的小鸡,不感染疟疾的蚊子,抗癌老鼠,翡翠海参,转基因动物,-,生物反应器,蜘蛛羊,1 2 1 2,野生型,转基因,抗真菌病的转基因草坪草,抗棉铃虫棉花,抗虫水稻,全球转基因农作物销售额及预测,2,、医药方面,利用重组,DNA,产生的工程菌来大量高效地合成人体活性多肽（疾病的诊断、预防和治疗）,基因工程疫苗（细菌疫苗、病毒疫苗、寄生虫疫苗）以及正在研制的癌症疫苗,3,、工业方面,3.1,酶制剂工业用酶的生产、酶的定向改造,3.3,环境保护,生物传感器,-,环境监测,生物修复,3.2,食品工业上,：,氨基酸，助鲜剂，甜味剂，食品添加剂,淀粉酶，纤维素酶。,3.4,化学与能源工业上：,基因工程修饰过的淀粉及重组,DNA,技术生产酒精等石,油替代品,喷洒工程菌清除石油污染,美国,GE,公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,分子生物学,已经渗透到生物学的几乎所有领域,分子生物学,已经成为生命科学领域的带头学科,分子结构生物学,分子发育生物学,分子神经生物学,分子育种学,分子肿瘤学,分子细胞生物学,分子免疫学,分子病毒学,分子生理学,分子考古学,分子遗传学,分子数量遗传学,分子生态学,分子进化学,.,分子生物学,成为现代生命科学的,“,共同语言,”,和深入研究的工具，一门生命科学的基础学科。,分子生物学,使生命科学的各个领域在分子水平上密切联系，互相渗透，交叉融合，从而成为了解所有生命现象的分子基础。,微生物,遗 传,细 胞,农 林,医 学,生态,环境,生 理,分 子,课程大纲：,绪论,第一章,DNA,的结构,第二章 有机体、染色体和基因,第三章,DNA,的,复制,第四章,RNA,转录,第五章 蛋白质,翻译,第六章 原核生物基因表达,调控,分子生物学的概念,蛋白质,及,核酸,等生物大分子,结构,和,功能,的研究都属于分子生物学的范畴，即从分子水平阐明生命现象和生物学规律,偏重于,核酸（基因）,的分子生物学，主要研究基因或,DNA,的复制,、,转录,、,表达,和,调控,等过程，以涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究,基因的分子生物学,Molecular Biology,广义的分子生物学：,狭义的分子生物学：,分子生物学的三大原则,*,构成生物大分子的,单体,是相同的,共同的核酸语言（,Nt,）共同的蛋白质语言（,aa,）,*,生物遗传信息表达的,中心法则,相同,DNA,RNA,polypeptides,protein,character,protein,*,生物大分子,单体的排列,（核苷酸、氨基酸）个性,高级结构 生物大分子之间的互作,第一章,DNA,的结构,第一节 遗传物质的本质,第二节 核酸的化学组成,第三节,DNA,的二级结构,第四节,DNA,的物理化学性质,第一节 遗传物质的本质,a,、编码蛋白质和,RNA,的信息,(,编码,tRNA,、,rRNA),64,个三联体密码子,3,个终止密码子,编码氨基酸的,61,个密码子有简并性、通用性,一、,DNA,携带两类不同的遗传信息,b,、编码基因选择性表达的信息,基因选择性表达,表现在：,细胞周期的不同时相中,个体发育不同阶段,不同的器官和组织,不同的外界环境下基因的表达与否以及量的差异,*,原核生物的结构基因占,Genome,的比例很大,x174phage 5386bp,结构基因用去,5169bp,比例达,96,*,真核生物的结构基因占,Genome,的比例很小,哺乳动物中结构基因只占,10,15,其余,80,以上的,DNA,起什么作用目前还无法精确解释，,但可以肯定其中大部分,DNA,序列是编码基因选择性表达的遗传信息,所以又称调控序列,二、,RNA,也可作为遗传物质,*RNA,病毒,传染媒介是病毒颗粒（,病毒基因组,RNA,、蛋白质外壳,）,如,:,烟草花叶病毒,（,Tobacco Mosaic Virus,，,TMV),*,类病毒,（,viroid,）,使高等植物产生疾病的传染性因子分子结构：含,246375,个核苷酸的,单链环状,RNA,分子，没有蛋白质,外壳。,专性活细胞内寄生。,三、是否存在核酸以外的遗传物质,Prion(proteinaccous infections particle),朊病毒蛋白质样的感染因子,羊搔痒病,(scripie),人类库鲁（,kuru,）,病,牛海绵状脑炎,(,疯牛病,),均由,传染性病原蛋白颗粒,引起,统称,Prion,(,朊病毒,),Prion,复制,?,转录,?,翻译,?,朊病毒蛋白有两种构象：细胞型（正常型,PrPc,）和瘙痒型（致病型,PrPsc,）。,PrPsc,可胁迫,PrPc,转化为,PrPsc,，实现自我复制，并产生病理效应；,致病原理：,基因突变可导致细胞型,PrPsc,中的,螺旋结构不稳定，至一定量时产生自发性转化，,片层增加，最终变为,PrPsc,型。,朊病毒带来了诺贝尔生理,/,医学奖,1997,Stanley B.Prusiner,发现朊病毒是作为老年性痴呆症等疾病的病原并能在寄主细胞中传播,第二节 核酸的化学组成,嘧啶,Pyrimidines,嘌呤,Purines,一、碱基、核苷、核苷酸,碱基,Nitrogenous bases,Uracil(U),核苷,（,nucleotide,）,糖苷键,Glycosidic bond,嘧啶的,1,位,N,原子、嘌呤的,9,位,N,原子,核糖是戊糖,RNA,核糖核苷,DNA,脱氧核糖核苷,1,9,核苷酸,（,nucleotide acid,）,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸,其中,和,、,和,之间是,高能磷酸键,dNTP,碱基戊糖核苷 核苷磷酸核苷酸,核糖核苷三磷酸缩写为,NTP,二、,DNA,分子的一级结构,(DNA sequence),1,、,多聚核苷酸链,主链是核糖和磷酸,侧链为碱基,由,3,5,磷酸二酯键,连接,2,、链的方向：同一个磷酸基的,3,酯键到,5,酯键的方向,(5,3,),5-UCAGGCUA-3,=UCAGGCUA,默认书写顺序,53,3,5,3,、一级结构的概念,指,DNA,分子中的核苷酸排列顺序。简称,DNA,序列,或,序列,。,由于核苷酸之间的差异仅仅是碱基的不同，故可称为,碱基序列,。,不同生物借此贮存遗传信息,决定,DNA,的二级结构和高级结构,第三节,DNA,的二级结构,*,1953.Watsosn&Crick,右手,B-DNA Double helix Model,一、,DNA,双螺旋模型（,double helix model,）,每一单链具有,5,3,极性,两条单链极性相反,反向平行,两条单链间以氢键,连接,以中心为轴,，,向 右,盘 旋（,直径,2nm,）,双螺旋中存在,大,/,小沟,*,双螺旋的主链,磷酸二酯链,(,Phosphodiester,Backbone),C-G,T-A,碱基互补,直径,20,*,双螺旋模型参数,螺距为,34,（任一条链,绕轴一周所升降的距离）,每圈有,10,个核苷酸,（碱基）,有大沟和小沟,配对碱基并不充满双,螺旋空间，且碱基对,占据的空间不对称,两个碱基之间的垂直,距离是,3.4,。螺旋转,角是,36,度,Pitch,34,Rise,3.4,Width 20,Major,Groove,Minor,Groove,10.4 bp/turn,Twist 36,二、,影响双螺旋结构稳定性的因素,l,氢键,(Hydrogen bond 46 kc/mol),消除,DNA,单链上磷酸基团间的静电斥力,弱键,可加热解链,氢键堆积,有序排列,(,线性,方向,),l,磷酸酯键,(phosphoester bond 8090 kc/mol),l,0.2 mol/L Na,+,生理盐条件,强键,需酶促解链,*,维持稳定性的因素,l,磷酸基团间的静电斥力,碱基内能增加,(,温度,),使氢键因碱基排列有序,状态的破坏而减弱,*,不稳定因素,三、双螺旋结构的基本形式,B-DNA,资料来自相对湿度为,92,所得到的,DNA,钠盐纤维,此外人们还发现了,A,、,C,、,D,、,E,等右手双螺旋和左手双螺旋,Z,构象等形式,DNA,结构的多态性：几种不同的,DNA,双螺旋结构以及同,一种双螺旋结构内参数存在差异的现象。,A,B,Z,Handedness,Base Inclination,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽浅,大沟不存在,小沟窄而深,反向重复序列与二级结构,反向重复序列,（,inverted repeats,；,IR,）,又称回文序列（廻文）,：指两段同样的核苷酸序列同时存,在于一个分子中，但具有相反的方向有时也有不完全相,同的情况。,RNA,和,DNA,中都可能存在,此外还可有,d,irected,r,epeatitive sequence-,正向重复序列,四、一些,DNA,序列的不寻常结构,C,反向重复序列间间隔较短或无间隔,反向重复序列间间隔较长,*,较短的回文序列可能是作为一种信号,如,：,限制性内切酶的识别位点,一些调控蛋白的识别位点,例如限制性内切酶,EcoR,的识别位点,5,GAATTC,3,3,CTTAAG,5,第四节,DNA,的物理、化学性质,一、,DNA,分子的变性,变性（,denaturation,或熔解,melting,）：,DNA,双螺旋区的,氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这,一双链分离的过程叫做变性。,1,、条件：加热，极端,pH,，有机溶剂，低盐浓度等。,2,、变性过程的表现,是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很,窄的温度范围,导致一些理化性质发生剧烈变化,表现为：,熔液黏度降低,沉降速度加大,此外吸收值升高（,A,260,nm,），即,增色效应,指在,DNA,变性的过程中，它在,260nm,的吸收值先是缓慢,上升，达到某一温度时及骤然上升,天然,DNA,和变性,DNA,的吸收值相差可达,34,D.S DNA A,260,=1.0,S.S DNA A,260,=1.37,dNTPs A,260,=1.60,当浓度为,50g/ml,时：,1.185,1.0,1.37,OD,Tm,=OD,增加值的中点温度,(,一般为,85-95),或,DNA,双螺旋结构失去一半时的温度,3,、熔解曲线与,熔解温度,(,Tm,值,),缓慢而均匀地增加,DNA,溶液的温度（现可做到,0.1,分）,可根据各,点的,A260,值绘制成,DNA,的熔解曲线,这也是一般,PCR,实验技术中把变性温度定为,94,的原因,4,、影响,Tm,值的因素,（,1,）在,A,T,C,G,随机分布的情况下，决定于,GC,含量,（,2,）,GC%,含量相同的情况下,GC%,愈高 ,Tm,值愈大,AT,形成变性核心，变性加快，,Tm,值小,（,3,）变性液中含有尿素，甲酰胺等,尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键,改变碱基对间的氢键,Tm,值可降至,40,左右,（,4,）盐浓度的影响,每升,0.18mol Na,+,是常用的标准条件,思考题：室温下蒸馏水中的,DNA,会如何？,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH,2,NH,2,+,(,质子化,),改变氢键的形成与结合力,（,5,）极端,pH,条件的影响,一切减弱氢键，碱基堆积力的因素,均将使,Tm,值降低,5,、常用的变性方法,热变性,碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3,时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链,DNA,的,首选,方法,保存单链,DNA,的条件：,保持,pH,大于,11.3,盐浓度低于,0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,Denaturation ,Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞,(Depends on the collision of complementary S.S.DNA),二、,DNA,分子的复性（,anneal or renaturation,）,概念：变性,DNA,在适当条件下，两条彼此分开的链又可以,重新地合成双螺旋结构的过程（退火）。,1,、,影响,DNA,复性过程的因素,：,复性反应的温度,低于,Tm,值,25,左右,(60-65),S.S,DNA,的初始浓度,C,0,DNA,分子中,碱基的排列状况,(,随机排列,重复排列,),S.S.DNA,分子的长度（片段的大小）,S.S.DNA,愈长,S.S.DNA,愈短,分子扩散愈慢,复性愈慢,分子扩散愈快,复性愈快,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,三、,C,0,t,曲线复性发生过程的讨论,dC,t,/dt=-KC,0,2,反应初始,t=0,单链,DNA,的随机碰撞过程（,randomly collision,）,单链,DNA,浓度,=C,0,反应达,t,时,单链,DNA,浓度,=C,t,K,复性速度常数,包括两个因素：,DNA,的浓度（,C,，,mol/L,）和时间,(s),dC,t,/dt=KC,0,2,积分,C,t,/C,0,=1/(1+KC,0,t ),当,C,t,/C,0,=1/2,时,C,t,/C,0,=1/2=1/(1+KC,0,t,(1/2),),K=1/C,o,t,(1/2),C,o,t,(1/2),=1/K(mol.Sec/L),常数,Ct/C,0,是,C,0,t,的函数,按此公式作图得,C,0,t,曲线,C,t,/C,0,0,1,C,0,t,(1/2),C,0,t,复杂性,*,C,0,t,和,DNA,的复杂性间存在线性关系：,the more complex a DNA,the higher its,Cot,(1/2),1 :10,6,2,10,5,:0.4,210,9,:4000,A typical mammalian C0t curve has three plateaus,*,C,0,t,曲线能解释单一来源的,DNA,所具有的不同复杂性部分,真核生物的基因组由,高度重复（,highly repetitive),序列、,中度重复（,moderately repetitive or mid-repetitive),序列,单一（,single copy),序列组成,复习题,1,、名词解释,广义分子生物学 狭义分子生物学,反向重复序列,Cot,曲线,Cot,1/2,DNA,变性,DNA,的熔解温度,(,Tm,值,),DNA,复性,2,、简答题,DNA,是否唯一的遗传物质？,如何确定,DNA,一级结构的方向性？,决定,DNA,双螺旋结构状态的因素如何？,DNA,结构多态性及其产生的原因。,室温中蒸馏水中的,DNA,变化如何？为什么？,本章内容结束，谢谢！,