第三章-细胞生物学研究方法111课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 细胞形态结构的观察方法,1.,光学显微镜技术,（light microscopy）,2,.,电子显微镜技术,(Electro microscopy),第二节 细胞组分的分析方法,1.,离心分离技术,2.,细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,3.,特异蛋白抗原的定位与定性,4.,细胞内特异核酸的定位与定性,5.,定量细胞化学分析技术,第三节 细胞培养、细胞工程,细胞培养,细胞工程,微分干涉显微镜(DIC),优点,：能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故,影像的立体感更强,。,用途,：DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。,微分干涉显微镜(DIC),计算机辅助的微分干涉显微镜可以得到很高的反差，其分辨率比普通光镜提高了一个数量级，这不仅填充了普通光镜与电镜之间分辨率的间隙，也为高分辨率下研究活细胞提供了必要工具。,2.电子显微镜技术,2.1 透射,电子显微镜的基本知识,2.1.1,电镜与光镜的比较,2.1.2,电镜与光镜光路图比较,2.1.3,电子显微镜的基本构造,2.1.4,主要电镜制样技术,2.1.4.1,超薄切片技术,2.1.4.2,负染色技术,2.1.4.3,冰冻蚀刻技术,2.2,扫描电子显微镜,（Scanning electron microscope，SEM,）,扫描电子显微镜,作用,：,用来观察标本的表面结构。,工作原理,：,用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子由探测体收集，并被转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。,冰冻蚀刻技术,冰冻蚀刻,也称冰冻断裂（freeze-fracture,）,标本置于-100C的干冰或-196C的液氮中，进行冰冻,然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出断面结构，称为蚀刻（etching）。蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。,负染色技术,负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右,超薄切片技术,通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片厚2050nm,普通复式,光学显微镜技术,分辨率是指区分开两个质点间的最小距离,N=介质折射率；,=镜口角,，,=入射光波长,荧光显微镜,技术,（Fluorescence Microscopy）,1.2.1,原理,：高压汞灯，激发滤片，阻断滤片,直接荧光标记技术,免疫荧光标记技术,（间接标记）,1.2.2应用,在光镜水平用于蛋白质、核酸,等生物大分子的定性定位：,如,绿色荧光蛋白,(GFP)的应用,绿色荧光蛋白,GFP是一个分子量较小的蛋白，易与其他一些目的基因产物形成融合蛋白，且不影响目的基因产物的空间构象和功能。GFP与目的基因融合，将目的基因产物标记为绿色，可定量分析目的基因的表达水平，显示其在细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在细胞中的作用及其分子机制提供便利条件。,（,Laser Scanning Confocal Microscopy,）,1.3.1,原理,:物镜与聚光镜聚焦于同一点上，排除焦平面以外光的干扰，增强 图像反差和提高分辨率(1.41.7倍)，可重构样品的,三维结构,。,1.3.2,应用：可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。,激光扫描共聚焦显微境,LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管,原理,：将,相位差,转换成振幅差，从而提高各种结构间的对比度。,结构,：环状光澜，相差物镜,用途,：可用于,观察活细胞,相差显微镜,电镜与光镜的比较,显微镜,分辨本领,光源,透镜,真空,成像原理,LM,TEM,200nm,100nm,0.1nm,可见光（400-700）,紫外光,（约200nm),电子束,（0.01-0.9）,玻璃透镜,玻璃透镜,电磁透镜,不要求真空,不要求真空,要求真空,1.33x10,-5,1.33x10,-3,Pa,利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化,利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,2.3 扫描电镜,原理与应用,：,电子“探针”扫描，激发样品表面放出二次电子，探测器收集二次电子成象。,CO,2,临界点干燥法可以消除引起样品变形的表面张力问题,1.离心分离技术,1.1 用途：于分离细胞器与生物大分子及其复合物,1.2 种类:,差速离心,：,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器.,密度梯度离心,：,用一定的介质在离心管内形成密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，又分为熟读沉降和等密度沉降两种。常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖,。,2.细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,原理,：利用一些显色剂与所检测物质中一些,特殊基团特异性结合的特征，通过显,色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来,判断某种物质在细胞中的,分布和含量,。,3.,特异蛋白抗原的定位与定性（,免疫细胞化学,）,定义：根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗,原进行定位测定的技术。,3.1,免疫荧光技术,：,分为,直接免疫荧光鱼间接免疫荧光,。,快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。,3.2,免疫电镜技术,：,免疫铁蛋白技术,免疫酶标技术,免疫胶体金技术,应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的分泌动态；胞内酶的研究；膜蛋白的定位与骨架蛋白的定位等,直接免疫荧光鱼间接免疫荧光,4.细胞内特异核酸的定位与定性（原位,分子杂交技术,）,用来检测染色体上的特殊DNA序列。最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了,免疫探针法,，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。,4.1,光镜水平的原位杂交技术,探针用同位素标记或荧光素标记,4.2 电镜水平的原位杂交技术,探针用生物素标记，用与抗生物素抗体相连的胶体金标记显示,免疫探针法,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,5.定量细胞化学分析技术,5.1,细胞显微分光光度术,（Microspectrophotometry）,利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质在细胞内的含量。,5.2,流式细胞仪,（Flow Cytometry）：,流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。,用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体。,1.细胞培养,活细胞离体后要在一定的生理条件下才能存活和进行生理活动，特别是高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。,动物细胞的生存环境与植物细胞差别很大，因而二者的培养方法很不相同。,1.1,动物细胞培养,1.2,植物细胞培养,1.2,植物细胞培养,1.2.1 组织培养,：诱发产生,愈伤组织,，如果条件适宜，可培养出再生植株。用于研究植物的生长发育、分化和遗传变异；进行无性繁殖；制取代谢产物。,1.2.2 悬浮细胞培养,：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。,1.2,植物细胞培养,1.2.3 原生质体培养,：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast），其特点是：比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA；便于进行细胞融合，形成杂交细胞；与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株：,1.2.4 单倍体培养,：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。,植物细胞培养产生的愈伤组织,1.1,动物细胞培养（一）,培养方式大致可分为两种：,1.1.1,群体培养,（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合（confluence）后形成均匀的单细胞层；,1.1.2,克隆培养,（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。,1.1,动物细胞培养（二）,原代培养,：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。,接触抑制,：细胞进行体外培养时，分散贴壁生长的细胞一旦相互汇合接触，即停止移动和生长的现象。,克隆,（clone）：亦称无性繁殖系或简称无性系。对细胞来说，克隆是指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。,细胞株,（cell strain）：,通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株。,细胞系,（cell line）：,原代培养物经首次传代成功即称为细胞系,因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。大多数二倍体细胞为有限细胞系。,群体培养（左）和克隆培养（右）,2.细胞工程,即,细胞水平的生物工程,使用的主要技术有细胞培养、定向诱导分化、细胞融合和显微注射等。,2.1,细胞融合,（,cell fusion,）技术,2.2,单克隆抗体,（monoclone antibody）技术,2.3,显微操作,技术,2.1细胞融合,通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cell fusion）或细胞杂交（cell hybridization）。,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体，来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体。,细胞融合的常用方法,一、灭活病毒法：,二、聚乙二醇（PEG）法：,三、电融合法：,二、聚乙二醇（PEG）法,PEG分子式：HOH,2,C（CH,20,CH,2,）,n,CH,2,OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。通常选用平均相对分子质量为10004000、浓,度在30%50%的PEG进行动物细胞的诱导融合。,PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合.,三、电融合法,细胞首先在交变电场中极化并沿电力线排列成串，形成细胞间的紧密连接；然后在高强度、短时程的直流电脉冲作用下，在其膜上会短暂地形成小孔，两个细胞紧贴的部分就会融舍而导致杂交细胞的产生。,电融合法的优点：,融合率高，重复性强，对细胞伤害小；,装置精巧，方法简单，可在显微镜下观察或录像观察融合过程；,免去,PEG,诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。,Light Pathway of Microscope,DAPI染色显示的前中期染色体,明视场与相差的观察效果比较,DIC显微镜下的硅藻,冰冻蚀刻电镜照片,人类血细胞SEM照片,差速离心法分离各种细胞组分,2.3显微操作技术,在高倍复式显微镜下，利用,显微操作器,（micromanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。,显微操作技术包括细胞核移植、,显微注射,、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。,尼康NT-88NE显微操作/注射仪,2.2单克隆抗体技术,单克隆抗体技术是细胞杂交技术的成功应用，正常淋巴细胞（如小鼠脾细胞）具有分泌抗体的能力，但不能在体外长期培养，瘤细胞（如骨髓瘤）可以在体外长期培养，但不分泌抗体。于是英国人Kohler和Milstein 1975将两种细胞杂交而创立了单克隆抗体技术，获1984年诺贝尔奖。,致敏B淋巴细胞,用目的抗原免疫小鼠时，应选用纯系、健康的8周龄BALBc小白鼠作为免疫动物，这样可以获得大量激活的淋巴细胞。,一般将各种病毒、细菌和癌细胞作为目的抗原接种动物制作抗原，其方法是将目的抗原进行腹腔或皮下注射，一般要进行初次免疫、二次免疫和加强免疫。加强免疫后45天，取脾脏分离B淋巴细胞备用。,骨髓瘤细胞选择,骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体,选择次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT,-,）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK,-,）瘤细胞,细胞内DNA的合成途径,从头合成途径：,以氨基酸和其他小分子起始合成核苷酸，进而合成DNA 的过程；可被叶酸类似物,氨基蝶呤（A）,阻断；,旁路合成途径,：,胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（,TK,）利用胸腺嘧啶核苷（T）合成DNA；次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（,HGPRT,）利用次黄嘌呤（H）合成DNA。,HAT选择培养基,含次黄嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的培养基，是动物杂交细胞筛选中最常用的方法。在这种培养基中细胞只能利用旁路途径合成DNA，因而只有具有,HGPRT,+,或/和,TK,+,的细胞才能生长,。,在HAT选择培养基中,骨髓瘤瘤细胞（HGPRT,-,或TK,-,）：,不能增殖死亡；,B淋巴细胞：,正常细胞，体外培养条件下增殖次数有限死亡；,杂交瘤细胞：,存活,转基因显微操作过程,Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养,复习纲要,基本知识：显微镜的基本原理 各类显微镜的基本用途 透射和扫描电镜的基本原理及制样技术 了解各种细胞成分分析方法的原理 了解细胞工程常用的几种技术,二、名词：差速离心 密度梯度离心 免疫荧光技术 原位杂交 群体培养 克隆培养 细胞融合 单克隆抗体 模式生物,三、要点：能根据研究目的选用合适的研究方法,