微生物基因突变.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物基因突变,野生型（,wild type）：,在微生物遗传学研究中，人们通常把从自然界中分离的菌株称为野生型,，,发生突变的相应个体或群体称为突变型。,突变体（,mutant）：,在遗传学中，把携带有突变的生物个体或群体称为突变体。,表现型（,phenotype）：,突变后产生的可观察或可检测的性状称为表现型。,基因型（,genotype）：,把生物个体的基因组,DNA,分子的核苷酸序列称为基因型,。,一、基因突变的类型,基因突变可从突变发生方式、引起的表型和遗传物质改变等几个方面进行分类。,按突变体表型特征可将突变体分为以下4类：,形态突变型、生化突变型、致死突变型、条件致死突变型,第一节 基因突变的类型、符号和规律,按遗传信息的改变方式可将突变分为以下3类：,错义突变：,突变造成所编码蛋白的氨基酸序列的变化,同义突变：,碱基改变后编码的氨基酸与野生型的氨基酸相同,无义突变：,当碱基突变后形成终止密码子，使蛋白质合成提前终止。,根据遗传物质的结构改变，分为：,碱基置换,移码,DNA,片段的插入和缺失,根据突变发生的方式分为：,自发突变和诱发突变,普遍性,无论是低等生物，还是高等的动植物以及人，都可能发生基因突变。基因突变在自然界的物种中广泛存在。,随机性,指基因突变的发生在时间上、个体、位点、所产生的表型变化等都是随机的。,独立性,在微生物群体中，基因突变是独立发生的，某一个基因的突变与另一基因突变之间是互不相关的独立事件。,稳定性,基因突变的实质是遗传物质发生改变的结果，因此突变型基因和野生型基因一样，具有相对的稳定性，是可以遗传的。,二、基因突变的规律,稀有性,突变是极为稀有的，野生型基因以极低的突变率发生突变。,可逆性,突变基因又可以通过突变而成为野生型基因，这一过程称为回复突变。,少利多害性,一般基因突变会产生不利的影响，被淘汰或是死亡，但有极少数会使物种增强适应性。,不定向性,一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因。,细 菌,抗 性,突 变 率,绿脓杆菌,链霉素,410,-10,大肠杆菌,链霉素,110,-10,志贺杆菌,链霉素,310,-10,百日咳嗜血杆菌,链霉素,110,-10,伤寒沙门氏菌,链霉素,110,-10,大肠杆菌,噬菌体,T3,110,-7,大肠杆菌,噬菌体,T1,310,-8,金黄色葡萄球菌,磺胺噻唑,110,-9,金黄色葡萄球菌,青霉素,110,-7,巨大芽孢杆菌,异烟肼,510,-9,巨大芽孢杆菌,对氨基柳酸,110,-5,几种细菌抗性自发突变的频率,抗药性突变的发生与药物的存在无关。,抗药性突变以一定的突变率发生。,各种抗药性突变的发生各不相关。,抗药性突变型具有稳定性。,抗药性突变型可回复突变,抗药性突变率可通过理化因素处理而提高。,抗药性突变是,DNA,分子某一特定位置结构改变的结果。,以细菌抗药性突变为例进一步说明,基因突变的规律,三、基因的命名规则和符号,每个基因用斜体小写的三个英文字母来表示，这三个字母取自表示该基因特性的一个或一组英文单词的前三个字母。如,str,表示,streptomycin,链霉素抗性基因。,产生同一表型的不同基因，在三个字母后用不同的大写斜体英文字母表示。如,trp,代表色氨酸基因，各个不同的色氨酸基因分别用,trpA,、,trpB,来表示。,1966,年，,M.Demerec,提出了大肠杆菌的基因命名规则，其要点：,突变型基因的表示是在基因符号的右上角加“-”，如亮氨酸缺陷型用,leu,-,表示。抗药性基因是在基因符号的右上角加上“,r”,表示抗性，加上“,s”,表示敏感。如,str,r,表示链霉素抗性。,某一突变型基因的表型一般也用相应的正体三个字母表示，不过第一个字母要大写。如乳糖发酵缺陷型基因用,lacZ,表示，其表型则需用,LacZ,-,表示。,当染色体上存在缺失时用“,”,表示，缺失部分放在,符号的括号中。如,（,lac-pro,）,表示乳糖发酵基因到脯氨酸合成基因这一段染色体发生了缺失。,上述规则主要在原核生物中使用，,1995,年，被收录到,TIG,遗传命名指南,中，真核生物特别是高等生物尚未遵循此规则。,TIG:,Trends in Genetics Genetic Nomenclature Guide,第二节 基因突变的分子基础,一、碱基置换及其对遗传信息的影响,碱基置换又可分为两种类型：,转换（,transition）,和颠换（,transversion）,AT GC,CG TA,红线双箭头为转换,绿线单箭头为颠换,无义突变,二、移码突变及其对遗传信息的影响,移码突变,（,frame-shift mutation）,是指编码蛋白质的,DNA,序列中插入或缺失一个碱基，使翻译的阅读框发生改变而导致多肽链的氨基酸序列的完全改变。,三、缺失和重复对遗传信息的影响,大片段的缺失或重复（超过几个碱基对）是基因突变的主要原因之一。特别是在放线菌中的自发突变，其缺失或重复范围从几个基因到几十个基因。,第三节 自发突变与环境适应,一、自发突变和诱发突变,突变可分为自发突变和诱发突变。,自发突变,（,spontaneous mutation）,是指在自然条件下出现的基因突变。,诱发突变,（,induced mutation）,简称诱变，是指利用物理、化学和生物因素人工诱发产生的基因突变。,二、自发突变的证实,有三个著名的实验对细菌抗药性来源进行了研究：,波动实验,涂布实验,影印实验,波动实验（,fluctuation test）,Luria,和,Delbruck（1943,年）,涂布实验（,plate spread test）,Newcombe（Nature 1949,年）,在12个平板上涂对,T1,敏感的,E.coli，5*10,4,/,皿,培养3-5小时,小菌落生长时产生抗,T1,突变，每个平板上,5*10,4,菌落，5000个细菌/菌落,6个平板喷入,T1，,培养,6个平板重新涂布后，喷入,T1，,培养,1个抗,T1,菌落,多个抗,T1,菌落,影印实验（,replica plating test）,Lederberg（1952,年）,三、自发突变的机制,自发突变是在自然条件下产生的突变。从本质上讲，突变不论是自然发生的，还是诱发产生的，都是通过理化因子作用于,DNA，,使其结构发生变化最终改变遗传性状的过程。,引起自发突变的原因徐了与微生物所处的外界环境条件外，还与细胞内自身的化学反应、,DNA,分子内部的自身运动、转座因子等因素有关。,DNA,分子内部运动,碱基脱氨基作用：,如“,C”,脱氨基生成“,T”。,互变异构效应：,“,T”,可以酮式或烯醇式两种状态存在，酮式与“,A”,配对，烯醇式与“,G”,配对。“,C”,和“,A”,则可以氨基或亚氨基两种状态存在，“,C”,的亚氨基与“,A”,配对。,DNA,的环出效应与缺失,自发产生缺失的机制，可能与,DNA,在复制或修复中的差错有关，一条,DNA,链发生环状突起，当复制进行时环状突起区域不复制，这样环状突起区域在子代中就发生缺失。,1,A,B,C,A,B,C,B,A,C,C,A,自身代谢产物：硫氢化合物、重氮丝氨酸、过氧化氢等,环境因素：各种短波辐射、高温、低浓度诱变物质等,第四节 诱变剂和诱变机制,诱发突变（,induced mutation）,简称诱变，是指利用物理、化学和生物因素人工诱发产生的基因突变。能够引起基因突变的物理、生物因素称,诱变因素,，化学试剂称,诱变剂,。,诱变因素种类繁多，诱变机理也不尽相同，常用的诱变因素分为以下几类：,一、碱基类似物,二、作用于,DNA,分子化合物,三、嵌合剂,四、各种辐射,诱变因素,作用方式,DNA,分子变化,碱基类似物,5-溴尿嘧啶,替代,T，,偶尔发生与,G,配对,AT-GC，,偶有,GC-AT,碱基对的转换,2-氨基嘌呤,替代,A，,错误与,C,配对,AT-GC,碱基对转换,作用,DNA,的试剂,亚硝酸（,HNO,2,）,使,A,和,C,脱氨基,AT-GC,和,GC-AT,对转换,羟胺（,NH,2,OH）,与,C,作用,GC-AT,碱基对转换,甲基磺酸乙酯（,EMS）,使,G,甲基化，错误与,T,配对,GC-AT,碱基对转换,氮芥、丝裂霉素、亚硝基胍,使,DNA,链交联并被,DNase,切除,造成点突变和缺失,嵌合剂：,吖啶类、溴化乙锭,在两个碱基对间插入,导致移码或小段缺失,辐射,紫外线（,UV）,形成嘧啶二聚体,导致,DNA,的错误修复或缺失,离子辐射（如,X-,射线）,自由基损伤,DNA，,造成链断裂,导致,DNA,的错误修复或缺失,一些化学和物理诱变因素的诱变功能,一、碱基类似物,碱基类似物,：是指类似于正常的含氮碱基并且能够在,DNA,复制过程中被整合到正在合成的核苷酸链中的化合物。,诱变处理方法（以,5-Bu,为例）,将新鲜斜面的细菌菌种,接种液体培养基中（前培养）,对数生长期,离心收集菌体,加入生理盐水或缓冲液,饥饿,8-10,小时（以消耗胞内的贮存物质）,加入,5-Bu,到菌悬液中（终浓度,25-40ug/ml,）,混匀后，取,0.1-0.2ml,菌悬液涂布到平板培养基上,在适宜温度下培养（即诱变处理）,培养后挑取单个菌落，进行筛选,注：如果处理真菌、放线菌孢子，则应提高,5-Bu,的浓度，通常为,0.1-1mg/ml,。加诱变剂后，需要振荡培养,6-12,小时，以绝大多数孢子刚刚萌发为度，涂平板处理培养。,二、,DNA,分子上碱基的化学修饰,这类化学诱变剂有：,亚硝酸（,HNO,2,）,羟胺（,NH,2,OH）,烷化剂,常见的烷化剂包括：,甲基磺酸乙酯（,EMS）,硫酸二乙酯（,DES）,N-,甲基-,N-,硝基-,N-,亚硝基胍（,NTG）,氮芥等。,（一）亚硝酸的诱变机制,亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的,DNA,分,子,，脱去碱基中的,氨基,变成,酮基,，改变碱基氢键的电位，引起转换而发生变异。,腺嘌呤（,A）,脱氨基变为次黄嘌呤（,H）,A,T,H,T,H,C,A,T,G,C,H,C,第一次复制,第二次复制,亚硝酸引起碱基脱氨基作用，由,A,变成,H,时，第一次,DNA,复制后，次黄嘌呤不与胸腺嘧啶配对，而与胞嘧啶配对，第二次复制后,A:T,转换为,G:C,。,脱氨基的结果：,腺嘌呤（,A）,变为次黄嘌呤（,H）,胞嘧啶（,C）,变为尿嘧啶（,U）,鸟嘌呤（,G）,变为黄嘌呤（,X）,由,C,变成,U,时，第一次,DNA,复制尿嘧啶不与鸟嘌呤而与腺嘌呤互配，第二次复制后,G:C,转换为,A:T,；,当,G,变成,X,时，与以上两种情况不同，黄嘌呤仍然和胞嘧啶配对。,1试剂的配制,（1）1,mol/L pH4.5,醋酸缓冲液,称取醋酸6.12,g，,加蒸馏水定容100,ml。,称取醋酸钠8.2,g，,加蒸馏水定容100,ml。,将醋酸钠溶液缓缓加入到醋酸溶液中，搅拌均匀，调节,pH,至4.5，两者之比大约为1:1。,（2）0.1,mol/L,亚硝酸钠溶液,称取亚硝酸钠0.69,g，,加蒸馏水定容100,ml。,（3）0.07mol/L pH8.6,磷酸氢二钠溶液,称取磷酸氢二钠（,Na,2,HPO,4,2H,2,O）1.246g，,加蒸馏水定容100,ml。,以上试剂使用前均要灭菌。,2处理方法（以处理浓度0.025,mol/L,为例）,取1,ml,孢子悬液,2,ml pH4.5,醋酸缓冲液,1,ml,0.1,mol,亚硝酸钠溶液,(,处理浓度为0.025,mol/L),于2526保温1020,min,加入20,ml,0.07,mol、pH8.6,的磷酸氢二钠溶液,，,使,pH,下降至6.8左右，以终止反应,稀释分离于平板,如果处理细菌，亚硝酸最后浓度以0.05,mol,：,将斜面新鲜菌体移人肉汤培养基,适温培养到对数期,将培养液进行离心，弃去上清液,用生理盐水洗涤,pH4.5,醋酸缓冲液和0.1,mol/L,硝酸钠溶液1：1加入沉淀的菌体中，使之悬浮。,于3537处理510,min,加入5倍的,pH8.6,的磷酸氢二钠溶液，使,pH,下降到6.8。,取一定量进行后培养1.52,h。,稀释分离于平板上,在亚硝酸处理菌体或孢子时要严格控制好温度，否则会影响诱变效果。,（二）羟胺的诱变机制,羟胺是具有特异诱变效应的诱变剂，专一地诱发,G:CA:T,的转换。对噬菌体、离体,DNA,专一性更强。,DNA,分子上和羟胺发生反应的碱基主要是羟化胞嘧啶上的氨基。,羟胺与亲电试剂，如烷基化试剂反应生成,N,或,O,取代产物：,R-X+NH,2,OH R-ONH,2,+HX,R-X+NH,2,OH R-NHOH+HX,C,G,C*,G,C*,A,C,G,T,A,C*,A,第一次复制,第二次复制,HA,当羟胺浓度为0.11.0,mol/L，,pH6.0,时，它专一地与,胞嘧啶,起反应，而羟化后的胞嘧啶与腺嘌呤配对，引起,G:CA:T,转换,当羟胺浓度为0.11.0,molL，,pH9.0,时，主要与,尿嘧啶,反应；,在低浓度，如10,-3,molL，pH9.0,时，羟胺可以与,胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶,起反应。,但据分析，羟胺与,T、G,反应的是它的产物，而不是它本身。,此外，羟胺有时还能和细胞中其他物质作用产生过氧化氢，也具有诱变作用。,根据诱变机制，羟胺不能使突变回复，即不能使,A:TG:C,转换，进行逆向突变。因此，可以用来鉴别突变体是,A:TG:C,还是,G:CA:T,转换。,这种鉴别常用于碱基类似物和亚硝酸等诱变剂诱发回复突变体的碱基转换。,羟胺的处理方法：,常用浓度为0.1%5%，可直接在溶液中处理，时间12,h，,然后分离培养。,但一般都加到琼脂平板或振荡培养基中，然后接入孢子或细菌，在适温下培养，生长过程中处理，所用浓度比直接处理时低些。,作用：,1.,脱嘌呤,DNA,链的断裂或少数核苷酸的缺失致死效应,2.,碱基的烷化错误配对点突变,烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。它们大部分半衰期很短，其长短与温度、溶液,pH,关系很大。,(三)烷化剂,化 合 物 名 称,半 衰 期/,h,20,30,37,硫芥子气,约3,min,甲基磺酸甲酯,68,20,9.1,甲基磺酸乙酯,96,26,10.4,甲基磺酸正丙酯,111,37,甲基磺酸异丙酯,108,35,13.6,甲基磺酸正丁酯,105,33,硫酸二乙酯,3.34,1,3（40测定）,3-氯-1，2-环氧丙烷,36.3,N-,亚硝基-,N-,甲基尿烷,35,N-,亚硝基-,N-,乙基尿烷,84,一些烷化剂在水中（,pH=7）,的半衰期,11-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(简称亚硝基胍，,NTG,或,NG),NTG,能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。,NTG,还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。,NTG,在水溶液中随着不同的,pH,将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。,当溶液,pH,低于5.5时,，,NTG,分解成,HNO,2,，HNO,2,本身就具诱变作用；,当溶液,pH,在8.0以上时,，,NTG,会分解产生重氮甲烷(,CH,2,N,2,)，,对核酸起烷化作用，引起微生物突变；,当溶液,pH,为6.0时,，,NTG,本身和,DNA,起烷化反应而导致突变。通常在,pH6.0,的条件下进行诱变处理。,取新鲜的斜面，用一定,pH,值的磷酸缓冲液或,Tris,缓冲液洗下细菌作成菌悬液。,如果采用细菌细胞或丝状菌孢子(真菌或放线菌)须进行前培养，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，则可用缓冲液制成悬液，浓度约在10,6,10,7,ml,-1,NTG,的诱变处理方法：,配制,NTG,母液：由于,NTG,不溶于水，配制需加助溶剂甲酰胺或丙酮，然后加缓冲溶液，其比例为9：1(缓冲溶液9,ml：NTG,丙酮溶液1,ml)，,一般,NTG,母液浓度配成,1mg/ml。,使用时取母液0.2,ml，,加菌悬液1.8,ml，NTG,最后处理浓度为0.1,mg/ml。,将菌悬液和,NTG,盛于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温(细菌3035、真菌2528、放线菌3032)处理若干时间，一般细菌为2060,min，,孢子90120,min。,终止反应：用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去上清液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。,对于细菌，将培养液按一定浓度加入到沉淀菌体中，振荡培养1.52,h，,使细胞分裂,23,次，再浠释涂皿。,还可以按以下方法诱变处理，插瓶振荡处理：,在接菌后的培养液中加人510,g/ml NTG，,并加几滴吐温80或吐温60，使成乳化状,(注意吐温对该菌生长是否有影响),在平皿上处理：将,NTG、,琼脂和菌体混合制成平板，,NTG,浓度为10-50,g/ml。,或将先倒平板，然后将,NTG,和菌体混合涂抹平板，此时,NTG,浓度为1020,g/ml。,NTG,是一种强致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过,NTG,的器皿必须及时、单独处理。用自来水大量冲洗或用12,mol/L,的,NaOH,或2%的,Na,2,S,2,O,3,浸泡过夜，洗净。,甲基磺酸乙酯是磺酸酯类中诱变效应较好的一种烷基化合物，外观呈粉末状或无色液体，难溶于水，不稳定，易水解成无活性物质。,因此，要低温、干燥保存。诱变效应最佳,pH,为,7.0,7.4,。,配制,EMS,和制备菌悬液都要用一定的缓冲溶液，这不仅影响诱变剂渗透到细胞内的速度，而且也影响诱变剂的稳定性。,2甲基磺酸乙酯(又称乙基硫酸甲烷，简称,EMS),分子式：,CH,3,SO,2,OCH,2,CH,3,EMS 0.5mol,L,浓度母液的配制：由于,EMS,有毒性，尤其在高浓度情况下，容易挥发。为了安全和防止失效，配制前将需用的器皿，置冰箱内预冷，然后在冰浴中进行配制。取,0.5ml EMS,原液，加入到,10ml pH 7.2,的磷酸缓冲液中，加盖封口，并轻轻转动试管。由于在水溶液中易失效，故尽可能低温保藏，并现用现配。,取新鲜的菌体，经前培养至对数期，离心洗涤，用缓冲液制成,8ml,菌悬液,(10,7,10,8/,ml),。对于丝状菌孢子，则前培养至萌动期，菌悬液含菌,10,6,10,7/,ml,。,EMS,的诱变处理方法：,取,EMS,母液,2ml,，加入到以上,8ml,的菌悬液中，在适宜温度下处理一定时间,(,根据预实验结果确定,),。处理的最终浓度为,0.1 mol,L,。对于真菌孢子，则为,0.20.5mol/L,。,EMS,处理一定时间后，用,50,倍生理盐水稀释或加入一定量的,2%Na,2,S,2,O,3,溶液，或多次离心、洗涤，以终止反应，然后将菌体作成一定稀释度，进行平板分离。如果是细菌，将,20ml,肉汤培养基加到以上菌体沉淀物中，培养,1.52h,，再稀释分离培养。,EMS,是剧毒的诱变剂，在整个诱变过程，包括配制药品、操作处理、保存等都要严守安全，不能接触皮肤，所有接触过,EMS,的器皿，单独用大量水冲洗洗涤，或用,10%Na,2,S,2,O,3,溶液浸泡过夜，再用清水冲洗干净。,DES,是无色的液体，不溶于水，溶于乙醇，具一定毒性，很不稳定。,DES,在水溶液中半衰期很短，,20,时为,3.3h,，,30,时为,1h,，,40,时仅,0.3h,。因此，要严格做到随用随配，并且要低温、干燥、避光保存。,3,硫酸二乙酯,(DES),DES,诱变效应同样受酸碱条件的影响，,pH,中性时效应最好，配制溶液和制备菌悬液都要用,0.1mol,L pH7.2,的磷酸缓冲液。,取,DES,原液,0.4ml,于灭菌试管中，加人少量乙醇使其溶解，再加进,pH7.2,的磷酸缓冲液,19.6ml,，配成体积分数为,2%,的溶液；,用同一种磷酸缓冲液将新鲜斜面的细菌或真菌孢子洗下，制成菌悬液；,取以上,DES,溶液和菌悬液等量,(,如,1:1),加入到无菌试管内混合，最后处理浓度为,1%,，在一定的温度下，振荡处理,2060min,；,诱变处理结束加入生理盐水稀释，或加入,2%Na,2,S,2,O,3,0.5ml,终止反应。如果是细菌，将,20ml,肉汤培养基加入到以上菌体沉淀物中，进行,1.5,2h,后培养，然后稀释、分离于平皿。,DES,的处理方法：,(,以处理浓度,1%,为例,),三、嵌合剂和移码突变,能够引起,DNA,链中一个或几个碱基的插入或缺失的化合物称为,嵌合剂,，常用的有吖啶橙、吖啶黄等吖啶类衍生物、,ICR-171,、,ICR191,等。,这类化合物由于其分子结构及大小类似于嘌呤：嘧啶碱基对，在水溶液中能嵌入到双链,DNA,分子的碱基堆中，当,DNA,进行复制时，就会造成多出一个或几个碱基，或少了一个或几个碱基而引起,移码突变,。,DNA,双链上的两个碱基之间插入吖啶类化合物分子，使,DNA,链拉长，两碱基间距离拉宽。,这类化合物与,DNA,结合后，使碱基插入或缺失，在,DNA,复制时造成点突变，使后面的所有碱基都往后或往前移动，引起全体三联密码转录、翻译错误而突变，故称这种突变为移码突变。,吖啶化合物的诱变机制,吖啶黄是淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇和乙醚，不稳定，遇光易分解，须避光保存。,吖啶黄使用时，先用少许乙醇溶解，配成一定浓度的母液。通常处理方法是将它们加入培养基中，使最后浓度为,1050g/ml,，混合后制成平板，将处理菌悬液分离其上，适温培养，在生长过程中处理。,另外，还可将吖啶黄加入到培养液中，浓度为,1020g/ml,，在适温条件下，振荡培养过程中处理。,2,吖啶黄的性质和使用方法,种类,保藏方法,清除方法,危险反应,磺酸酯类和硫酸酯类,低温、干燥、避光,用过量的的,NaHCO,3,粉末覆盖或,12mol/L NaOH,浸泡灭活，再用大量水浸泡,48-72h,，用,10%,的硫代硫酸钠溶液浸泡清洗。,与双氧水可发生激烈反应；误咽入应立即诱致呕吐，再用盐水或其他碱性溶液灌洗，并检查肾功能,亚硝基化合物类,小单位低温保存，避免碰撞、摩擦,用纸吸附后挖坑焚烧；水擦洗后，再用,10%,的硫代硫酸钠溶液擦试。,具挥发性，会伤及人眼；超过,200,时，因放热反应而发生爆炸，有机化合物存在时，低温下也可能发生爆炸；可引起人眼角膜溃痛，气喘，接触性皮炎等,亚胺的芥子气类,于充满,NaOH,的干燥器中冷藏,用纸吸附再焚烧，污染物品用浓肥皂水洗涤；注意避开烟雾。,酸类物质存在时，可发生爆炸；变态反应，皮肤病和肺心病患者不能接触,羟胺类,小量干燥冷藏,用过量,NaHCO,3,粉末覆盖，再和过量水冲洗。,易引起呼吸道疾病和皮炎等,化学诱变剂操作安全须知,四、辐射诱变,紫外线、,X-,射线、激光、离子束等都能引起基因突变。辐射的诱变作用有直接和间接两种方式：,直接作用,是使,DNA,发生断裂、缺失等,间接作用,是使细胞中染色体以外的物质发生变化，然后这些物质再作用于染色体而引起突变。,波长范围：136-390,nm,诱变有效波长：200-300,nm,碱基吸收波长：254,nm（,诱变效果最强）,紫外线的诱变机制是目前了解得较清楚、应用较广泛的一种非电离辐射的诱变因素。,紫外线（,UV：Uitraviolet）,的诱变机制,主要引起,DNA,断裂、,DNA,分子间或分子内的交联、胞嘧啶与尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成等。其中，最主要的生物学效应是引起胸腺嘧啶二聚体形成。,UV,的作用机制：,X-,射线、,-,射线都属于电离辐射，带有较高的能量，能引起被照射物质中原子的电离，故称,电离辐射,。,室外活体辐射圃,室内辐射源,电离辐射的诱变作用,激光诱变作用,激光和普通光在本质上都是电磁波。普通光源的发光主要是自发发射，激光是激光器内部对光的发射过程进行控制，而产生受激发射。,微生物细胞在,He-Ne,激光的作用下，产生辐射活化效应，表现为形态结构上的改变，以及生理代谢发生变化。,利用激光对酵母、芽孢杆菌等进行诱变后，都得到较好的效果。,离子束诱变是利用离子注入设备产生高能离子束,(4060keV),并注入生物体引起遗传物质的永久改变，然后从变异菌株中选育优良菌株的方法。,离子束诱变术,离子注入生物体时，具有能量传递、动量交换、离子沉积和电荷积累的过程。而其它辐射诱变仅仅只有能量交换；化学诱变考虑的也只是分子基团的交换。,因此，离子注入不仅兼有辐射诱变和化学诱变的特点和功能，而且可以通过精确控制离子种类、注入参数，使离子的能量、动量、电荷等根据需要进行组合，使诱变具有一定的重复性和方向性。,第五节 基因突变与,DNA,损伤的修复,DNA,损伤类型很多，细胞内修复系统也不尽相同。根据修复途径和参与酶类，将,DNA,损伤修复大致归纳为：,光修复,切补修复,错配修复,重组修复,SOS,修复,等,一、光修复,（,photoreactivation）,二、切补修复（,excision repair）,切补修复：,是细胞内一种不依赖可见光来切,除,胸腺嘧啶,二,聚体的修复系统，所以也称暗修复。,UvrABC,切补修复的机制,三、错配修复,（mismatch repair）,错配修复（,mismatch repair）,是由甲基化引导的修复系统，是大肠杆菌主要修复系统之一。其特点是特异性不强，能修复,DNA,双链结构中任何轻微的损伤，包括错配、移码、碱基类似物替代等。而,DNA,的重大损伤则由其它修复系统进行修复。,CH,3,利用母链甲基化，子链未甲基化状态,3,MutL,将,MutS,和,MutH,结合在一起，形成,DNA,链和三个蛋白复合物,2,MutH,则结合到离错配碱基最近的半甲基化位点上,1,MutS,识别并结合到错配位点上,5 在,DNA,多聚酶,I,和连接酶作用下，以母链为模板合成正确的子链,4 由核酸外切酶从切口处朝错配位点进行降解,由,MutH,在未甲基化的子链上产生切口,甲基化介导的错配修复机制：,四、重组修复（,recombination repair）,重组修复,是一种依赖于重组酶（,RecA）,的修复系统。与光修复和切补修复不同的是，重组修复发生在,DNA,复制过程中或复制后，而光修复和切补修复均发生在,DNA,复制之前。,在重组修复过程中，,RecA,蛋白结合到缺口处的单链,DNA,上,与相应正常,DNA,双链形成三链区,由正常,DNA,双链中的母链与带有缺口的子链进行重组,子链中的缺口由母链替代，而被交换到母链上的缺口则由,DNA,聚合酶和连接酶进行修复,1,2,3,4,1,2,3,4,1,2,3,4,1,2,3,4,1,2,3,4,1,2,3,4,五、,SOS,修复（,SOS response）,SOS,修复,是,DNA,分子受到较大范围损伤时诱导产生的一种,DNA,修复系统。它具有复杂的细胞学机制，受到损伤的,DNA,作为求救信号（,save our soul）,引发了涉及,DNA,修复的多种细胞功能参与协调作用。因此是细胞受到危急状态时的修复方式。,由于,SOS,系统在修复某些,DNA,时，是在没有模板条件下,进行,的，因而出现许多错误的修复,而,引起,基因,突变。这种修复也是一种,倾向错误修复的,DNA,修复机制,，从而导致,基因突变,。,SOS,反应涉及的酶类和修复机制,切除修复的基因：,uvrA uvrB uvrC,重组修复的基因：,recA,其他基因：,lexA,umuC umuD,lexA,是一种调节基因，其产物是个阻遏蛋白。所有,SOS,基因的操纵子都含有,LexA,的结合位点，,LexA,通过与,uvrA uvrB uvrC umuC umuD recA,等基因结合而阻遏这些基因的表达。同时对自身基因（,lexA,）,的表达也起抑制作用,recA,基因（,Clark,1965）,在研究大肠杆菌重组时发现的。,recA,突变体具有多效性，除重组外，还与,DNA,修复、细胞分裂等有关。,recA,基因产物有两大功能：,a,水解,LexA,阻遏蛋白，从而使它所抑制的基因得以表达并参与修复；,b,RecA,蛋白在,DNA,重组过程中促进,DNA,分子的同源配对。,当,DNA,损伤时，则激活了,RecA,蛋白的酶活性并使组遏蛋白,LexA,失,活。,umuC、umuD,两个基因属于同一转录单元，共用一个启动子。在正常细胞中，这两个基因被,LexA,蛋白所阻遏。当细胞中,DNA,受损伤后，它们才能转录。,UmuC、UmuD,蛋白允许,DNA,聚合酶通过,DNA,损伤部位而进化复制，使染色体完成复制和细胞分裂。然而，在复制时不能保证损伤的碱基正确配对。,SOS,反应与,UmuC、UmuD,的功能,六、突变体的形成,突变的形成是一个复杂的过程和一系列变化的结果，影响这些变化中的任何一个环节都会关系到突变体的形成。,前突变,-,突变,-,突变体,前突变,：是指一种可能引起突变的损伤,突变,：是指遗传物质的一种遗传性的变化,突变体,：是指具有突变表型的特殊细胞或个体,不改变遗传性状,显性突变和隐性突变的表型效应（二倍体生物）,突变的表型与环境（基因间的协调作用、有的表型随环境不同而不同：如脉孢菌在有光条件下，菌落为红色，在黑暗下为白色）,表型迟延（,phenotype lag,）：表型的改变落后于基因突 变的发生的现象。,分离迟延,（,segregational lag,）：大肠杆菌细胞一般含有两个核质体，突变基因常常是隐性，只有两个核质体都带有这一突变基因时，细胞的表型才是突变型。,生理迟延,（,physiological lag,）：突变基因由杂合变为纯合时也不一定出现突变表型，因为基因产物的消耗有一个过程，需要一定的代谢时间。,突变的表型效应：,突变型的种类：,抗药性突变,抗原性突变,糖发酵突变,营养缺陷型突变,抗噬菌体突变,产量突变,形态突变,本章思考题：,概念：何谓基因型、表现型、野生型、突变型、致死突变、条件致死突变？,按突变表型特征可将突变体分为哪几类？,试述基因突变的规律？,为什么说自发突变与环境无直接对应关系？简述证实该结论实验（,3,个经典实验）的原理和步骤？,简述引起自发突变的原因？,何谓诱发突变？诱变剂有哪些种类？,试述,5-Bu,诱变的分子机理和处理方法？,为什么亚硝酸能作用于正在复制和未复制的,DNA,分子？,在一定条件下，羟胺处理突变体，得到和未得到回复突变体各说明什么问题？,试述,UV,引起基因突变的机理？,何谓光修复、切补修复、错配修复、重组修复和,SOS,修复？,绘图说明切补修复、错配修复、重组修复的机理？,试述参与,SOS,修复的酶类及其功能？,为什么说微生物突变体的形成是一个复杂的过程？,何谓表型迟延？说明产生表型迟延的原因？,