DNA和RNA提取原理和方法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA和RNA提取原理和方法,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,2,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,前言,3,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,第一部分：,DNA,提取方法简介,4,DNA,提取的几种方法,基因组,DNA,的提取,CTAB,法,SDS,法,其它,5,DNA,提取的几种方法,非基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体,DNA,的提取,差速离心结合,SDS,裂解法,6,基因组,DNA,CTAB,法,CTAB,法原理,（植物,DNA,提取经典方法）,CTAB,（,hexadecyltrimethylammonium bromide,，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。,具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里,该复合物在高盐溶液中（,0.7mol/L NaCl,）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB,溶液在低于,15,时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于,15,。,7,大家应该也有点累了，稍作休息,大家有疑问的，可以询问和交流,8,CTAB,提取缓冲液的经典配方,Tris-HCl,（,pH8.0,）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA,螯合,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使,DNP,（脱氧核糖核蛋白）。,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-,巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除,基因组,DNA,CTAB,法,9,褐变,10,CTAB,提取缓冲液的改进配方,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少,DNA,中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。,基因组,DNA,CTAB,法,11,PVP,（聚乙烯吡咯烷酮）,PVP,按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以,K,值表示，不同的,K,值分别代表相应的,PVP,平均分子量范围。,K,值实际上是与,PVP,水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用,K,值来表征,PVP,的平均分子量。通常,K,值越大，其粘度越大，粘接性越强。,在研磨过程中加入,PVP,，其中的,CO-N=,基有很强的结合多酚的能力，从源头上减少了酚类被氧化的机会。,同时向抽提液中加入还原剂,-,巯基乙醇，后者能打断多酚氧化酶中的二硫键，使多酚不易被氧化，随后经抽提而去除。,12,CTAB,法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,基因组,DNA,CTAB,法,13,SDS,法原理,基因组,DNA,SDS,法,SDS,是一种阴离子去垢剂，在高温（,55,65,）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐,(KAc,或,NH,4,Ac),浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；,上清液中的,DNA,用酚,/,氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的,DNA,。,SDS,法,DNA,提取缓冲液,14,2.65,水浴,60min,其间缓慢摇动几次。,3.,加入,150ul,的,5mol/LKac,混匀,冰浴,15min,左右,15,SDS,法流程图,（以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA,溶液,基因组,DNA,SDS,法,16,基因组,DNA,其它方法,物理方式,：玻璃珠法、,超声波法、研磨法、冻融法,化学方式,：异硫氰酸胍法、碱裂解法,生物方式,：酶法,根据细胞裂解方式的不同有：,17,基因组,DNA,其它方法,吸附材料结合法：,根据核酸分离纯化方式的不同有：,硅质材料,阴离子交换树脂,磁珠,高盐低,pH,值结合核酸，低盐高,pH,值洗脱。,快捷高效。,低盐高,pH,值结合核酸，高盐低,pH,值洗脱。,适用于纯度要求高的实验。,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。,18,基因组,DNA,其它方法,浓盐法,：,有机溶剂抽提法：,密度梯度离心法：,利用,RNP,和,DNP,在盐溶液中溶解度不同，将二者分离,有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用,利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物,19,质粒,DNA,碱裂解法,碱裂解法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当用碱处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在回到中性,pH,时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,20,质粒,DNA,碱裂解法,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,21,SDS,碱裂解法提取质粒,DNA,中溶液,1,的成分及作用,溶液,50mM,葡萄糖,/10mM EDTA/25mM Tris-HCl,，,pH=8.0,葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；,EDTA,抑制,DNase,的活性。这一步溶液中还可以加入,RNase,，不受,EDTA,影响，并且可以在后续步骤中被除去,溶液,0.2M NaOH/1%SDS,破细胞的主要是碱，而不是,SDS,，所以才叫碱法抽提。,溶液,III,3M,醋酸钾,/2M,醋酸,这一步的,K,置换了,SDS,（十二烷基磺酸钠）中的,Na,，得到,PDS,（十二烷基磺酸钾）沉淀；,SDS,易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个,SDS,分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组,DNA,也被,PDS,共沉淀,22,质粒,DNA,煮沸法,煮沸法原理,染色体,DNA,比质粒,DNA,分子大得多，且染色体,DNA,为,线状分子，而质粒,DNA,为共价闭合环状分子；,当加热处理,DNA,溶液时，线状染色体,DNA,容易发生变性，共价闭环的质粒,DNA,在冷却时即恢复其天然构象；,变性染色体,DNA,片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒,DNA,分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,23,细胞器,DNA,差速离心法,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的,比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。,24,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,25,DNA,提取的基本步骤,I.,材料准备,II.,破碎细胞或包膜内容物释放,III.,核酸分离、纯化,IV.,沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.,核酸溶解在适量缓冲液或水中,26,材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,提取血液基因组,DNA,时，要选择有核细胞（白细胞）,组培细胞培养时间不能过长，否则会造成,DNA,降解,含病毒的液体材料,DNA,含量较少，提取前先富集,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,27,严谨性质粒和松弛性质粒,按照复制性质，可以把质粒分为两类：,一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有,1,2,个质粒；,另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有,20,个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。,28,细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致,DNA,量少，纯度低,针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：,植物材料液氮研磨,动物组织匀浆或液氮研磨,组培细胞蛋白酶,K,细菌溶菌酶破壁,酵母破壁酶或玻璃珠,高温温浴时，定时轻柔振荡,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,菌体量适当,培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮,变性的时间不要过长（,5,分钟），否则质粒易被打断,复性时间也不宜过长，否则会有基因组,DNA,的污染,G,菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,29,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离,DNA,时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚,/,氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间（猕猴桃大提，,10000,转,20min,）,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,30,核酸分离、纯化,蛋白质的去除：,酚,/,氯仿抽提,使用变性剂变性（,SDS,、异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,蛋白酶处理,31,多糖的去除：,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入,1/2,体积的,5M NaCl,，高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加一定量的氯苯,(1/2,体积,),，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用,PEG,8000,代替乙醇沉淀,DNA,：在,500L DNA,液中加入,200l 20%PEG,8000,(,含,1.2 M NaCl),，冰浴,20min,。,核酸分离、纯化,32,多酚的去除：,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：,-,巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如,PVP,、,PEG(,聚乙二醇,),，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与,DNA,的结合,核酸分离、纯化,盐离子的去除：,70,的乙醇洗涤,33,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入,1/10,体积的,NaAc,（,pH5.2,，,3M,），有利于充分沉淀,沉淀后应用,70,的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg,2+,或,Mn,2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,基因组,DNA,的提取,质粒,DNA,的提取,34,DNA,中含有蛋白、多糖、多酚类杂质,DNA,在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应,DNA,中残留有金属离子,重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）,重新沉淀,DNA,，让酒精充分挥发,增加,70,乙醇洗涤的次数（,2-3,次）,DNA,提取常见问题,问题一：,DNA,样品不纯，抑制后续酶解和,PCR,反应。,原因,对,策,35,材料不新鲜或反复冻融,未很好抑制内源核酸酶的活性,提取过程操作过于剧烈，,DNA,被机械打断,外源核酸酶污染,反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融,液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液,在提取内源核酸酶含量丰富的材料的,DNA,时，可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔,所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌,将,DNA,分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,DNA,提取常见问题,问题二：,DNA,降解。,对,策,原因,36,实验材料不佳或量少,破壁或裂解不充分,沉淀不完全,洗涤时,DNA,丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料,动植物要匀浆研磨充分；,G,菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁,高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加,PK,的用量）,低温沉淀，延长沉淀时间,加辅助物，促进沉淀,洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,DNA,提取常见问题,问题三：,DNA,提取量少。,对,策,原因,37,猕猴桃,DNA,提取实例,1.CTAB,配方如上,配制好备用,65,度水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立即放到液氮中,避免酚类物质氧化,2.65,水浴一个小时,3.,氯仿：乙醇：异戊醇,=80:16:4,的抽提液 两次。,10000,转,/,分离心,20,分钟，尽量把丝状物压紧，避免吸取上清时有丝状物牵拉,等体积预冷的异丙醇，,75%,乙醇洗去其他杂质。洗两次。,用无水乙醇,5,毫升洗一次。晾干,5,分钟挥发掉乙醇后加入,3-5mlTE,溶解，加入,5ul,1mg/ml,的,RNA,酶后保存,38,猕猴桃基因组,DNA,39,40,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,第三部分：,RNA,提取方法简介,41,RNA,提取的通用方法,异硫氰酸胍,/,苯酚法,原理：,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,释放出来的,DNA,和,RNA,由于在特定,pH,下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；,有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净,RNA,。,RNA,提取的通用方法,42,异硫氰酸胍,/,苯酚法,步骤,:,材料准备：,尽量新鲜。,裂解变性,：,异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，,N-,月桂肌氨酸等）。,使细胞及核蛋白复合物变性，释放,RNA,，有效抑制核酸酶。,纯化分离：,苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚,/,氯仿可抽提去除杂物。,洗涤：,70,乙醇。,沉淀：,异丙醇、无水乙醇。,乙酸钠（,pH4.0,）：维持变性的细胞裂解液的,pH,值，沉淀,RNA,。,此外还常用氯化锂选择沉淀,RNA,。,RNA,提取的通用方法,43,影响,RNA,提取的因素,材料,：,新鲜，切忌使用反复冻融的材料,如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在,TRIzol,或样品贮存液中，于,70,或,20,保存,如要多次提取，请分成多份保存,液氮长期保存，,70,短期保存,影响,RNA,提取的因素,44,影响,RNA,提取的因素,样品破碎及裂解,：,根据不同材料选择不同的处理方法：,培养细胞：通常可直接加裂解液裂解,酵母和细菌：一般,TRIzol,可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁,动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻,样品量适当，保证充分裂解,为减少,DNA,污染，可适当加大裂解液的用量,影响,RNA,提取的因素,45,纯化：,在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；,经典的纯化方法，如,LiCl,沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成,RNA,降解；,柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响,RNA,后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。,影响,RNA,提取的因素,46,第一部分：,DNA,提取方法简介,第二部分：,DNA,提取常见问题、,原因分析及其对策,内容,第三部分：,RNA,提取方法简介,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,第四部分：,RNA,提取及其,RT-PCR,常见,问题、原因分析及其对策,47,RNA,提取常见问题,RNA,的降解,OD,260,/OD,280,比值偏低,电泳带型异常,下游实验效果不佳,48,RNA,降解,新鲜细胞或组织：,裂解液的质量,外源,RNase,的污染,裂解液的用量不足,组织裂解不充分,另外某些富含内源酶的样品,(,如脾脏，胸腺等,),，很难避免,RNA,的降解。,建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,49,RNA,降解,冷冻样品：,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至,-70,冰箱保存。样品要相对小一点；,先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；,样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,50,OD,260,/OD,280,比值偏低,蛋白质污染：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,减少起始样品量，确保裂解完全、彻底,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,苯酚残留：,不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。,解决办法,:,重新抽提一次，再沉淀，溶解。,51,OD,260,/OD,280,比值偏低,抽提试剂残留：,确保洗涤时要彻底悬浮,RNA,，并且彻底去掉,75%,乙醇。,解决办法,:,再沉淀一次后，溶解。,设备限制：,测定,OD260,及,OD280,数值时，要使,OD260,读数在,0.10-0.50,之间。此范围线性最好。,用水稀释样品：,测,OD,时，对照及样品稀释液请使用,10 mM Tris,，,pH 7.5,。用水作为稀释液将导致比值的降低。,52,电泳带型异常,非变性电泳：,上样量超过,3ug,，电压超过,6V/cm,，电泳缓冲液陈旧，均可能导致,28S,和,18S,条带分不开。,变性电泳条带变淡：,EB,与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性电泳要淡一些；,甲醛的质量不高,。,53,下游实验效果不佳,RNA,降解,抽提试剂的残留,75%,乙醇洗涤,样品中杂质的残留,多糖等杂质，再次沉淀,DNA,污染,使用,RNase-Free,的,DNase I,消化抽提,RNA,54,RT,常见问题分析和解决方案,问题一：少量或没有,RT-PCR,产物,可能原因,解决方案,55,RT,常见问题分析和解决方案,问题二：有非特异性带,引物和模板的非特异性退火,基因特异性引物设计较差,RNA,中有基因组,DNA,的污染,形成引物二聚体,镁离子浓度太高,提高反应的温度和特异性,提高引物的特异性,使用扩增级,DNase,处理,RNA,设计在,3,端没有互补序列的引物,优化镁离子浓度,可能原因,解决方案,56,RT,常见问题分析和解决方案,问题三：产生弥散（,smear,）条带,第一链产物的含量过高,PCR,反应中引物过多,循环数过多,退火温度过低,寡核苷酸片段产生的非特异性扩增,常规,PCR,步骤中减少第一链产物的量,减少引物的用量,减少,PCR,的循环次数,提高退火温度,提取高质量,RNA,，防止被,DNA,污染,可能原因,解决方案,57,