常用的微生物分离纯化方法.doc

(一) 常用得微生物分离纯化方法ﻫ　　ﻫ　　 菌种分离纯化得方法有:稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等、其中前三种方法最为常用,不需要特殊得仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下
　　ﻫ １、 稀释混合倒平板法ﻫ
　 平板就是指经熔化得固体培养基倒入无菌培养皿中,　冷却凝固而成得盛有固体培养基得平皿、该法就是先将待分离得含菌样品,　用无菌生理盐水作一系列得稀释(常用十倍稀释法, 稀释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许　(０.5—1。０ｍl)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷却至５０℃左右得琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后, 即成为可能含菌得琼脂平板。
ﻫ　　　于恒温箱中倒置培养一定时间后,　在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散得单个菌落。每个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成得。挑取单一个菌落,　一般再重复该法1—２次, 结合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正得纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量与稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。
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图4 混合倒平板操作法示意图 　 图５ 涂布平板操作法示意图 ﻫﻫ2、 稀释涂布平板法
采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点,一就是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成得菌落微小难于挑取;一就是在倾入熔化琼脂培养基时,若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌,过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 ﻫ　
　　 在微生物学研究中, 更常用得纯种分离方法就是稀释涂布平板法。该法就是将已熔化并冷却至约50℃(减少冷凝水)得琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却凝固后,将一定量(约0。１ ml)得某一稀释度得样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。ﻫ 　
　　 另一种简单快速有效得涂布平板法, 可省去含菌样品悬液得稀释, 直接吸取经振荡分散得样品悬浮液l滴加入１号琼脂平板上,　用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒再连续涂布2号、3号、4号平板(连续涂布起逐渐稀释作用,涂布平板数视样品浓度而定),　翻转此涂棒再涂布５号、6号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒连续涂布分离法。ﻫ
３. 平板划线分离法ﻫ 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离得含菌样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则得划线。划线得方式有连续划线、平行划线、扇形划线或其它形式得划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数得增加而减少, 并逐步分散开来。经培养后,可在平板表面形成分散得单个菌落。但单个菌落并不一定就是由单个细胞形成得,需再重复划线1—２次, 并结合显微镜检测个体形态特征,　才可获得真正得纯培养物。该法得特点就是简便快速、
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　 　 　 　 　图6 平板划线分离操作法示意图 ﻫﻫ　 个体细胞得生长难以测定, 而且生长与繁殖就是交替进行得, 因此,微生物得生长繁殖一般不就是依据个体细胞得大小,　而就是以群体细胞数目得增加作为指标得。测定微生物细胞数量得方法很多,　主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)法、膜过滤法等、

　 测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数得方法, 该计数方法被广泛应用于酒精、啤酒与白酒等得工业化生产中。

　 平板菌落计数法被广泛应用于食品、饮品、水质与活菌制剂等得含菌指数或污染程度得检测。该计数方法又称平板活菌计数法, 其最大优点就是可以获得活菌数得信息。但就是,　该计数法操作过程较繁, 需要培养一定时间才有结果, 且测定结果易受多种因素得影响、
　ﻫ　 　光电比浊计数法就是采用光电比色计或分光光度计, 测定菌悬液得光密度或透光度, 其优点就是简便迅速, 可以连续测定, 适合于自动控制。但该法除了受菌体浓度影响外, 还受细胞形态、大小、培养液成分及所采用光波长等因索得影响。

(一)显微镜直接计数法
　　该法就是将酵母菌或霉菌孢子悬液, 放在血球计数器载玻片与盖玻片之间得计数室中,在显微镜下直接进行计数,就是一种常用得微生物计数方法。ﻫ　　Tｈoｍａ血球计数板就是一块特制得厚载玻片, 玻片得中间部分刻有四条沟槽, 形成三个平台。中间得平台较宽且比两边得平台略低, 其中央刻有一小方格网得计数区, 计数区得面积为l平方毫米、另一种计数器中间平台得中间又被一短得横沟槽分为两半,　成为两个小平台, 每个小平台上面各刻有一个计数区,　共有两个计数区。当盖上特定盖玻片时,　盖玻片与计数室得空间厚度正好就是0。l毫米, 这样计数室得体积为0。l立方毫米, 即0．００0l毫升。计数室有两种刻度形式, 一种就是全区分16大格, 每大格再分2５小格, 一共4００小格。另一种就是全区分25大格, 每大格再分16小格,　也就是40０小格。 ﻫ

　　计数时,　可将酵母菌液(或孢子悬液)充满计数室, 在显微镜下按规定数4个或５个大格得总细胞数, 再求得每小格内平均得细胞数,　即可计算出每mｌ培养液中得细胞总数。ﻫ 　ﻫ　　 每ｍl菌液酵母菌细胞数　＝　每小格平均酵母细胞数×４00×10０0０×稀释倍数。
ﻫ(二)平板菌落计数法ﻫ 　
　该法得基本原理就是:将待测含菌样品经适当稀释,　使其中得微生物充分分散成单个细胞, 然后取一定量得稀释样品液, 接种到平板上。经过一定时间培养后, 由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见得单菌落, 即一个单菌落应代表原样品中得一个活菌、最后统计菌落数, 根据其稀释倍数与取样量,　换算出单位样品中所含得活菌数。
　ﻫ 　　实际上,由于待测样品不易完全分散成单个细胞, 故所形成得菌落并非都就是单菌落,　有一部分就是由2个以上得细胞长成得, 因此平板菌落计数得结果会比实际偏低。现在已采用菌落形成单位(cfu)来表示样品得活菌含量。 ﻫﻫ(三)光电比浊计数法
　光电比浊计数法得原理就是:光线透过菌悬液时,　其透光率与细胞浓度成反比, 而光密度与细胞浓度成正比。 透光率或光密度可以由光电池精确测出 (光波通常选择在40０～７00 nm之间), 因此, 可用一系列已知菌数得某种菌悬液测定光密度, 作出光密度与菌数标准曲线。这样,由样品液 (相同菌株与培养条件)所测得得光密度, 即可从标准曲线中查出对应得菌数。

　 　 　 ﻫ　　　 图7 光电比浊法测定细胞浓度得原理