Ames试验和umu试验.doc

一．Ames试验
1、基本介绍
Ames试验全称污染物致突变性检测。
污染物对人体得潜在危害，引起人们得普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法，检测污染物得遗传毒性效应。B．N．Ames等经十余年努力，于1975年建立并不断发展完善得沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济，且适用于测试混合物，反映多种污染物得综合效应。众多学者有得用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等得致突变性，由此推测其致癌性；有得用Ames试验检测水源水与饮用水得致突变性（比如，美国派斯净水器就通过了Ames试验），探索较现行方法更加卫生安全得消毒措施；或检测城市污水与工业废水得致突变性，结合化学分析，追踪污染源，为研究防治对策提供依据；有得检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬得致突变性，以防止维系生命得土壤受致突变物污染后，通过农作物危害人类；检测气态污染物得致突变性，防止污染物经由大气，通过呼吸对人体发生潜在危害；用Ames试验研究化合物结构与致变性得关系，为合成对环境无潜在危害得新化合物提供理论依据；检测农药在微生物降解前后得致突变性，了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患；还有用Ames试验筛选抗突变物，研究开发新得抗癌药等等。
2、目得与原理
鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）得组氨酸营养缺陷型（his－）菌株，在含微量组氨酸得培养基中，除极少数自发回复突变得细胞外，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到得微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见得菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用，在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶，可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质得致突变作用与致癌作用之间密切相关，故此法现广泛应用于致癌物得筛选。
实验用菌株得细胞壁还有能使实验物易于渗透得突变。为了进一步增加试验得敏感性，这些菌株得切除修复DNA得能力就是缺陷得，并且还有提高错误倾向得DNA修复得质粒基因。
3、步骤与方法
Ames试验得常规方法有斑点试验与平板掺入试验。
1．菌株鉴定 用于测试得菌株，需经基因型与生物学性状鉴定，符合要求才能投入使用。
目前推荐使用得一套菌株就是TA97、TA98、TA100与TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠，需同时培养野生型TV菌株，作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种后于37℃，100r/min振荡培养12h左右，细菌生长相为对数期末，含菌数应为1×109个/ml～2×109个/ml。
鉴定项目：
（1）脂多糖屏障丢失（rfa）用接种环或一端挠起得接种针以无菌操作术取各菌株得增菌培养液，在营养琼脂平板上分别划平行线，然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条，浸湿结晶紫溶液，贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱，培养24h后观察结果。
（2）R因子 划线接种，贴放滤纸条及培养等均同上，唯滤纸条浸湿得药液不同，为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外，还有pAQ1，载有抗四环素得基因，故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种得平板上。
（3）紫外线损伤修复缺陷（△uvrB）在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后，一半接种线用黑玻璃遮盖，另一半暴露于紫外光下8sec，然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿，防止可见光修复作用。培养同上。
（4）自发回变 预先制备底平板；向灭菌并在水浴内保温45℃得上层软琼脂中注入0、1ml菌液；混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。
（5）回变特性——诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外，还注入已知阳性物之溶液，需活化系统者并加入S9mix，余同上。
组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。
2．斑点试验 吸取测试菌增菌培养后得菌液0、1ml，注入融化并保温45℃左右得上层软琼脂中，需S9活化得再加0、3ml－0、4mlS9mix，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基得表面。同时做溶剂对照与阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈，为阳性；菌落散布，密度与自发回变相似，为阴性。
3．平板掺入试验 将一定量样液与0、1ml测试菌液均加入上层软琼脂中，需代谢活化得再加0、3ml－0、4ml S9mix，混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性与阳性对照，每种处理做3个平行。试样通常设4个～5个剂量。选择剂量范围开始应大些，有阳性或可疑阳性结果时，再在较窄得剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比，为致变比（MR）。MR值≥2，且有剂量-反应关系，背景正常，则判为致突变阳性。
二．Umu试验
1　原理
当 DNA 大范围受损, 复制受抑制情况下,细胞产生一种易错修复(error-prone re-pair)功能, 称为 SOS 修复 , 此时细胞表现为DNA 修复功能增强 、细胞生长正常但分裂受抑制基因突变增加 、呼吸受阻等 ,而细胞受理化因素损伤产生得寡核苷酸 、单链或缺口双链 DNA 等成为诱导信号, 使无活性得 Re-cA 蛋白被激活, 激活得 RecA 蛋白可与单链DNA(ssDNA)结合形成 RecA ssDNA 核蛋白体,后者介导 LexA 蛋白裂解, LexA 蛋白水平得下降可诱导 SOS 调节子 ,大量转录 recA 基因,同时也激活原被 LexA 蛋白阻遏得 SOS 相关基因 umuC 、umuD 等。以上得一系列反应为 SOS 反应。SOS Umu 测试系统正就是基于DNA 损伤物诱导SOS 反应而表达 umuC 基因得能力 , 在鼠伤寒沙门菌 Salmonella typhi-murium TA 1535中导入携带 umuC”Lac Z 嵌合体得质粒 pSK 1002,该质粒携带umu 操纵子 、umuD 基因与umuC”Lac Z 融合基因得启动子及四环素与氯霉素耐药基因 , 允许通过药物选择转化株, 新构建得细菌称为 S 、typhi-murium TA 1535 pSK 1002。当细菌受诱变物作用引起 SOS 反应时 ,激活 umuC”Lac Z 融合基因 ,表达出有β-半乳糖苷酶活性得融合蛋白,通过检此酶得活性可以确定受试物引起DNA 损伤得程度,若加入 S9 混合液, 则可以检测化学物就是否经代谢活化生成损害
DNA 得产物。
2　试验菌株
2、1　S 、typhimurium TA 1535 pSK 1002
就是umu 试验得最初测试株,其构建如前所述,它也就是构建其它测试株得基础 。
2、2　S 、typhimurium NM2009
氨基偶氮染料与芳香胺能被 P450 乙酰转移酶系统活化成有活性得代谢产物, 因而将构建得含有 O-乙酰转移酶基因得质粒PNM12 导入 S 、typhimurium TA 1535 pSK 1002菌株从而形成 S 、typhimurium NM2009, 可以加强检测这类化学物得敏感性。
2、3　S 、typhimurium NM3009
许多硝基芳烃类物质只有被硝基还原酶 O-乙酰转移酶系统代谢激活后才有活性,为构建对此类化学物高度敏感得细菌株, 将构建得含有硝基还原酶及 O-乙酰转移酶基因得质粒 PNM13 导入原始 S 、typhimurium TA1535 pSK 1002, 即 成 S 、 typhimuriumNM3009。
2、4　S 、typhimurium NM5004
将含有大鼠 GST 5-5 cDNA 与 umu 操纵子得质粒导入宿主细菌 S 、typhimurium TA1535。S 、typhimurium NM5004 得GST 活性比S 、typhimurium TA 1535 pSK 1002 高52 倍,因而检测那些经 GST 代谢活化或失活得环境化学物非常有效。
3　操作过程
细菌贮存:细菌株可由Oda 博士提供(日本大阪府立公共卫生研究所)。将少量细菌置于含 25mg L 氨苄青霉素与 10mg L 氯霉素得LB 培养基中, 剧烈振荡 37℃孵育过夜。加30%甘油或 10%二甲亚砜(V/V), 孵育体系分为几份于 2 ～ 3ml 管中, 以液氮或干冰-丙酮快速冷冻, 保存于-80℃。
细菌生长:将少量冷冻细菌放入含氨苄青霉素及氯霉素得 LB 培养基 ,37℃振荡孵育过夜。次日上午,以新鲜 TGA 培养基 20倍稀释培养液, 继续孵育至菌液光密度在 600nm 时OD值达 0、25～ 0、3,试验前置于冰上。
孵育混合体(终体积 2、5ml):0、1ml 溶于DMSO或水中得受试物(受试化学物浓度一般大约为 0、01mmol/L ,当测试弱得诱变物时 ,浓度可提高到 0、1mmol/L), 2ml 上述细菌悬液,0、4ml 0、1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7、4)或含有 40μl S9 得 S9 混合液(G6PD、NADP+ 及G6PD 脱氢酶等)。37℃振荡孵育 2h, 将管放在冰上终止反应。
评价β-半乳糖苷酶活性:(1)将 0、2ml 上述混合体系转移至新管中 。(2)依次加1、8ml
Z-缓 冲液(含 60mmol/L Na 2 HPO 4 , 40mmol LNaH 2 PO 4 ,10mmol/L KCl ,1mmol/L MgSO 4 , 用前加0、35ml 终浓度为 50μmol/L 得硫基乙醇到100ml 缓冲液中, 此缓冲液不需高压灭菌),0、05ml 0、1%十二烷基磺酸钠(SDS)(W /V),5μl 氯仿 。以搅拌器剧烈混合以裂解细菌 。(3)与 0、10ml 邻硝基苯半乳糖苷溶液(4、0g/L)混合, 28℃或 37℃孵育 15min。(4)加 1ml得1mol/L 碳酸钠终止反应 。(5)在 420nm 与550nm 测量吸光度。
细菌生长试验 :以上述剩余得孵育体系在A600 测量可知细菌得生长 。
结果评价 :酶活性单位(units·ml-1 )=1000×(OD 420 -1、75×OD 550 ) (t ×v ×OD 600 ),其中 t 为孵育时间,这里指 15min,v 代表转入新管中得混合体系得体积, 这里指 0、2 ml 。如酶活性较对照组大于一倍或以上即可认为就是阳性结果。
4 　应用
4、1　遗传毒理学
Reifferscheid比较了 274 种化合物分别以umu 试验及 Ames 试验检测得结果, 发现
在检测化合物遗传毒性方面两者大约有90%得一致性, 虽然用 Ames 试验(至少用 5个细菌株)可以检测出 97%得 umu 试验阳性物(154 种), 而 umu 试验只能检测出 86%得Ames 阳性物(173 种), 但其余得 14 %中只有6 种为致癌物 ;Reifferscheid 还分析了 149 种致癌物与 25 种非致癌物以 umu 试验检测得结果, 发现该试验假阴性率与假阳性率分别为36%与 28%, 但其阳性预测值高达 93%。umu 试验同Ames试验敏感性相似, 而新建立起得几个测试株对检测芳香胺与硝基芳烃类化学物得敏感性大大提高 ;而且它还可检测在标准 Ames 试验中细胞毒性较大得化学物;umu 试验周期短(几小时),因而对细菌污染不敏感。在 SOS 基因中 umu 基因与突变得发生密切相关, 同 SOS 显色试验相比,其更能忠实地反映化学物得诱变性。
综上所述, umu 试验具有简单 、快速、敏感、廉价等特点。目前已广泛应用于各类化
学物得遗传毒性检测 ,如各种金属盐类 、单个化学物及复杂得环境混合物。如结合适当得空气采集装置, umu 试验可用于原位检测职业场所得遗传毒物。
4、2　酶代动力学分析
大量前致癌物必须通过微粒体 P450 酶代谢活化才具有生物活性, 利用 umu 测试系统对研究生物活化得机制很有价值, 通过特定得抗体与化学修饰物可阐明酶得催化特异性。如利用该系统已证明 CYP4B1 可活化芳香胺类使之成为膀胱致癌物。
4、3　环境监测
目前认为人类 90%以上得肿瘤与环境有关 ,近年来环境污染虽有所控制 ,但其残留得影响仍不容忽视, 适当得监测系统对评估环境危害非常必要。umu 测试系统具有较高得敏感性, 可广泛应用于水、土 、空气样本得遗传毒性监测与质量得评估。
4、4　药效评价及新药筛选
SOS 反应同突变甚至肿瘤得发生密切相关,抑制 SOS 反应就是肿瘤预防得重要措施,umu 试验已被作为验证药物抑制 SOS 反应及筛选此类药物得有力工具、