微生物作业指导书.doc

XHR/JCZL-02-011-2014
西安宏兴乳业有限公司

微生物检验作业指导书
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2014-02-28实施

西安宏兴乳业有限公司发布

2014-02-25发布

目 录
目录·························································1
§1菌落总数···················································2
§2大肠菌群得测定·············································7
§3沙门氏菌检验··············································10
§4金黄色葡萄球菌检验········································15
§5阪崎肠杆菌得检验··········································18

西安宏兴乳业有限公司
菌落总数测定
1、术语与定义
菌落总数 (aerobic plate count)
食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度与培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成得微生物菌落总数。
2、设备与材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：
2、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2、3 烘箱。
2、4 天平：感量为 0、1 g。
2、5 均质器。
2、6 无菌吸管：1 mL（具 0、01 mL 刻度）、10 mL（具 0、1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2、7 无菌锥形瓶：容量 250 mL、500 mL。
2、8 无菌培养皿：直径 90 mm。
2、9 菌落计数器。
2、10试管，18*180，20*200。
3、培养基与试剂
3、1 平板计数琼脂培养基。
3、2 无菌生理盐水，0、85%。
4、检验程序
菌落总数得检验程序见下图：

↓

↓

↓

↓

5、操作步骤
5、1、样品得稀释
5、1、1 固体与半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水得无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有 225 mL 稀释液得无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 得样品匀液。
5、1、2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水得无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量得无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 得样品匀液。
5、1、3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液得无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成 1:100 得样品匀液。
5、1、4 按以上操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次1 mL 无菌吸管或吸头。
5、1、5 根据对样品污染状况得估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度得样品匀液（液体样

品可包括原液），在进行 10 倍递增稀释时，吸取 1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1 mL 空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。
5、1、6 及时将 15 mL～20 mL 冷却至 46 ℃得平板计数琼脂培养基倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
5、2 培养
5、2、1 待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ±1 ℃℃培养48 h±2 h。
5、2、2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长得菌落时，可在凝固后得琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约 4 mL），凝固后翻转平板，按 5、2、1 条件进行培养。
5、3 菌落计数
可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数与相应得菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。
5、3、1 选取菌落数在 30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长得平板计数菌落总数。低于 30 CFU得平板记录具体菌落数，大于 300 CFU得可记录为多不可计。每个稀释度得菌落数应采用两个平板得平均数。
5、3、2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长得平板作为该稀释度得菌落数；若片状菌落不到平板得一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
5、3、3 当平板上出现菌落间无明显界线得链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。
6、结果与报告
6、1菌落总数得计算方法
6、1、1 若只有一个稀释度平板上得菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数得平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g（mL）样品中菌落总数结果。
6、1、2 若有两个连续稀释度得平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
N=(1)

式中：
N——样品中菌落数；
∑C——平板（含适宜范围菌落数得平板）菌落数之与；
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d——稀释因子（第一稀释度）。
示例：
稀释度
1:100（第一稀释度）
1:1000（第二稀释度）
菌落数（CFU）
232，244
33，35
N=

=24727
上述数据按7、2、2数字修约后，表示为25000或2、5×104。
6、1、3 若所有稀释度得平板上菌落数均大于 300 CFU，则对稀释度最高得平板进行计数，其她平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
6、1、4 若所有稀释度得平板菌落数均小于 30 CFU，则应按稀释度最低得平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6、1、5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于 1乘以最低稀释倍数计算。
6、1、6 若所有稀释度得平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU之间， 其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近 30 CFU或 300 CFU得平均菌落数乘以稀释倍数计算。
6、2 菌落总数得报告
6、2、1 菌落数小于 100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。
6、2、2 菌落数大于或等于 100 CFU时，第 3位数字采用“四舍五入”原则修约。后，取前 2位数字，后面用 0 代替位数；也可用 10 得指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。
6、2、3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。
6、2、4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

6、2、5 称重取样以 CFU/g 为单位报告，体积取样以 CFU/mL 为单位报告。
7、备注
本方法参考国标GB4789、2-2010。

大肠菌群得测定（平板计数法）
1、术语与定义
1、1大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气得需氧与兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
1、2 最可能数 most probable number，MPN
基于泊松分布得一种间接计数方法。
2、设备与材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：
2、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2、3 烘箱。
2、4 天平：感量 0、1 g。
2、5 均质器。
2、6 无菌吸管：1 mL（具 0、01 mL 刻度）、10 mL（具 0、1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2、7 无菌锥形瓶：容量 500 mL。
2、8 无菌培养皿：直径 90 mm。
2、9 菌落计数器。
3、培养基与试剂
3、1 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）。
3、2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤。
3、3 无菌生理盐水,0、85%。
4、检验程序
大肠菌群平板计数法得检验程序见下图:

↓

36℃±1℃ ↓ 18-24h

↓

36℃±1℃↓24-48h

5、操作步骤
5、1样品得稀释
5、1、1 固体与半固体样品： 称取 25 g 样品,放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水得无菌均质杯内8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min,或放入盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水得无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10 得样品匀液。
5、1、2 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL生理盐水得无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量得无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 得样品匀液。
5、1、3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入 9 mL生理盐水得无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 得样品匀液。
5、1、4 根据对样品污染状况得估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1支 1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min。
5、2 平板计数
5、2、1选取2个～3个适宜得连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。

同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
5、2、2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃得结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。
5、3 平板菌落数得选择
选取菌落数在 15 CFU～150 CFU之间得平板，分别计数平板上出现得典型与可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色得胆盐沉淀环，菌落直径为 0、5 mm或更大。
5、4 证实试验
从 VRBA平板上挑取 10个不同类型得典型与可疑菌落，分别移种于 BGLB 肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养 24 h～48 h，观察产气情况。凡 BGLB 肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
5、5 大肠菌群平板计数得报告
经最后证实为大肠菌群阳性得试管比例乘以8、3中计数得平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型与可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管， 证实有6个阳性管， 则该样品得大肠菌群数为： 100×6/10×104/g （mL） =6、0×105 CFU/g（mL）。
6、备注
本方法参考国标GB4789、3-2010。

沙门氏菌检验
1、设备与材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：
1、1 冰箱：2 ℃～5 ℃。
1、2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，42 ℃±1 ℃。
1、3 均质器。
1、4 振荡器。
1、5 电子天平：感量 0、1 g。
1、6 无菌锥形瓶:容量 500 mL，250 mL。
1、7 无菌吸管：1 mL（具 0、01 mL 刻度） 、10 mL（具 0、1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
1、8 无菌培养皿：直径 90 mm。
1、9 无菌试管：3 mm×50 mm、10 mm×75 mm。
1、10 全自动微生物生化鉴定系统。
2、培养基与试剂
2、1 缓冲蛋白胨水（BPW）。
2、2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液。
2、3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液。
2、4 亚硫酸铋（BS）琼脂。
2、5 HE 琼脂。
2、6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂。
2、7 沙门氏菌属显色培养基。
2、8 三糖铁（TSI）琼脂。
2、9 赖氨酸脱羧酶试验培养基。
2、10 生化鉴定试剂盒。
3、 培养基与试剂
3、1 缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：
制法：称取20g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、2±0、2，121℃高压灭菌15min后取出。

3、2 四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：
制法：称取93、5g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、2±0、2，121℃高压灭菌20min后取出。临用前按每100mL加入P-72碘液一支与P-73 0、 1%煌绿一支，混匀后分装。
3、3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：
制法：称取23g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、0±0、2，加热煮沸灭菌，不要过度加热，定量分装备用。
3、4 亚硫酸铋（BS）琼脂：
制法：称取49、6g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、5±0、1，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃左右，摇匀，倾注平板备用。临用前一天配制。
3、5 HE琼脂：
制法：称取75、5g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、5±0、2，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃左右，倾注平板备用。
3、6 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：
制法：称取58、9g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、4±0、2，加热煮沸至完全溶解，冷却至55℃左右，倾注平板备用。不要过度加热、
3、7 沙门氏菌属显色培养基：
制法：称取34、9g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、6±0、2，加热煮沸灭菌，冷却至55℃左右，摇匀后铺制成平板备用。
3、8 三糖铁（TSI）琼脂：
制法：称取63、4g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、4±0、2，分装（每4mL左右为一管），115℃高压灭菌15min后取出，制成高层斜面备用。
3、9 赖氨酸脱羧酶试验培养基：
制法：称取1、9g于100mL蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至6、8±0、2，分装（每个小离心管装0、5mL），115℃高压灭菌10min后备用。
3、10 细菌微量生化鉴定管：
3、10、1 M 007-氨基酸脱羧酶对照
3、10、2 M 002-色氨酸肉汤
3、10、3 M 036-尿素酶
3、10、4 M 151-氰化钾培养基

3、10、5 M 152-氰化钾培养基对照
3、10、6 M 016-β-半乳糖苷（ONPG）
3、11 沙门氏菌属诊断血清A-F
4 操作步骤
4、1前增菌
4、1、1固体与液体：称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW得均质袋中，用手缓缓地摇动至充分溶解，于36℃±1℃培养8h～18h。
4、1、2物体表面：将检样混匀后，于36℃±1℃培养8h～18h。
4、2增菌
轻轻摇动培养过得样品混合物，移取1mL，转种于10 mL TTB内，于42℃±1 ℃培养18h～24h。同时，另取1mL，转种于10 mL SC 内，于36℃±1℃培养18 h～24 h。
4、3分离
分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个 BS琼脂平板与一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36℃±1℃分别培养 18 h～24 h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40 h～48 h（BS 琼脂平板），观察各个平板上生长得菌落, 各个平板上得菌落特征见表 1。
表1 沙门氏菌属在不同命选择性琼脂平板上得菌落特征
选择性琼脂平板
沙门氏菌
BS 琼脂
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色得菌落，周围培养基不变。
HE琼脂
蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色。
XLD琼脂
菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大得带光泽得黑色中心，或呈现全部黑色得菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。
沙门氏菌属显色培养基
菌落呈紫红色或紫色。
4、4生化鉴定
4、4、1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼
脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试

验培养基与对照培养基。同时，挑取可疑菌落接种于色氨酸（供做靛基质试验）、尿素琼脂、氰化钾（KCN）培养基、氰化钾培养基对照与ONPG。于36℃±1℃培养18h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表2、3判定结果。
表2 结果判定表
试验项目
阴性结果
阳性结果
说明
三糖铁
黄色或红色
有黑色物质产生
穿刺不可穿透琼脂至管底部。
赖氨酸
脱羧酶
对照
黄色
对照
黄色
接种完可疑菌落后滴加3-4滴灭菌液体石蜡覆盖液面。
试验
黄色
试验
紫色
色氨酸
黄色
玫瑰红色
培养后滴加2-3滴靛基质试剂，即刻观察结果。
尿素酶
黄色或橙色
玫瑰红色或红色

氰化钾
对照
生长
对照
生长
接种完可疑菌落后滴加3-4滴灭菌液体石蜡覆盖液面。
试验
不生长
试验
生长
ONPG
不变色
黄色
培养1-3h观察结果，如为阴性继续培养至24h、
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴定表
反应序号
硫化氢
靛基质
pH7、2尿素
氰化钾
赖氨酸脱羧酶
A1
+
—
—
—
+
A2
+
+
—
—
+
A3
—
—
—
—
＋/－
注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性
4、4、2、1反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 与赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴定表
pH7、2尿素
氰化钾
赖氨酸脱羧酶
判定结果
—
—
—
甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果）
—
+
+
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）
+
—
+
沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果）
注：＋表示阳性；＋表示阴性

4、4、2、2反应序号A2：补做甘露醇与山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。
4、4、2、3反应序号 A3：ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性；甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
4、5血清学鉴定
在清洁玻片上滴1滴血清，然后挑取1环待测菌与血清混匀，轻轻摇动玻片，1分钟内肉眼判断结果，试验应以生理盐水溶液作为阴性对照。于1分钟内呈明显凝集者为阳性，呈浑浊者为阴性。
5 结果与报告
综合以上生化试验与血清学鉴定得结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。
6 注意事项
6、1 一般干粉培养基应密封保存于阴凉干燥处，沙门氏菌显色培养基制备好得平板于2～8℃避光保存，其她配制好得药品无特殊要求可直接保存于冰箱中。
6、2 TTB增菌液应现配现用，不宜久置。沙门氏菌属显色培养基、亚硫酸铋（BS）琼脂、HE 琼脂、木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂、亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液均勿需高压灭菌。
6、3 划线接种时应采用三区法划线，并且接种针与接种环都必须灭菌彻底（连续灼烧三次）。前增菌以后得工作需在生物安全中进行。
6、4 在实验过程中若有菌液不慎洒出先用75%酒精棉球擦拭干净，实验完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并应定期对无菌室进行清洗消毒。
6、5 所有安瓿瓶无需加盖。对赖氨酸脱羧酶培养基、赖氨酸脱羧酶对照培养基、氰化钾培养基与氰化钾对照培养基在接种完菌落后需加液体石蜡2-3滴封口。
6、6 已经开袋得均质袋应保存于无菌室内，并尽快使用，避免污染。
6、7 将已挑取菌落平板保存于2～5℃得冰箱内，至少保留24h以备必要时复查。
6、8 废弃得培养液与培养基需经高压灭菌锅121℃灭菌30min后再废弃或清洗。
7、备注
本方法参考国标GB4789、4-2010。

金黄色葡萄球菌得测定
1 设备与材料 ：
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：
1、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
1、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
1、3 恒温水浴锅：37 ℃～65 ℃。
1、4 天平：感量 0、1 g。
1、5 无菌吸管：1 mL（具 0、01 mL 刻度）。
1、6 无菌均质袋：尺寸180×320×0、09
1、7 无菌培养皿：直径 90 mm。
1、8 精密 pH 试纸。
2 培养基与试剂 ：
下面所用培养基，如需调整pH值，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调
2、1 7、5 %氯化钠肉汤：
制法：称取7、5 %氯化钠肉汤90g于1L蒸馏水中，调pH值为7、4±0、2， 121℃高压灭菌15min后，冷却后放入冰箱备用。
2、2 血琼脂平板
2、3 Baird-Parker 琼脂平板：
制法：称取63、0g于1L蒸馏水中，加热煮佛至完全溶解，调pH值为7、0±0、2， 121℃高压灭菌15min后，冷至50℃时，每95ml加入1支亚碲酸钾卵黄增菌液，混匀后倾注平板后放入冰箱备用。
2、4 脑心浸出液肉汤（BHI）：
制法：称取24、5g于1L蒸馏水中，加热煮佛至完全溶解，调pH值为7、4±0、2，分装试管，每管5ml，121℃高压灭菌15min备用。
2、5 CM304冻干兔血浆：
用途：用于金黄色葡萄球菌得血浆凝固酶试验。
用法：每支安瓿瓶中加入0、5ml灭菌生理盐水，至完全溶解；然后，挑取可疑菌落溶入混匀或（加入0、3ml菌悬液混匀后），置36 ℃±1℃培养，在6h内定时观察结果。
2、6 革兰氏染色液
2、7 无菌生理盐水：
。

制法：称取8、5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌30min。
3 操作步骤
3、1 样品得处理：
3、1、1 样品：称取25g样品置盛有225 mL7、5 %氯化钠肉汤得无菌均质袋内，混合均匀。
3、2 增菌与分离培养：
3、2、1 将上述样品匀液于36℃±1℃培养箱内培养18h—24h。
3、2、2 将上述培养物，在生物安全柜内分别用三区法划线接种到Baird-Parker平板与血平板上，血平板36℃±1℃培养18h—24h ，Baird-Parker平板36 ℃±1℃培养18h—24h或45h—48h。（使用前，如 Baird-Parker平板表面有水珠，可放在 25 ℃～50 ℃得培养箱里干燥，直到平板表面得水珠消失。）
3、3 菌落形态：
金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm—3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样得硬度，偶然会遇到非脂肪溶解得类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存得冷冻或干燥食品中所分离得菌落比典型菌落所产生得黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑去上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。
4鉴定：
4、1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0、5mm～1mm。
4、1、1 染色流程：初染→媒染→脱色→复染→镜检。
① 取一干净得载玻片，滴一滴蒸馏水，再向蒸馏水中挑取一环可疑菌落，涂抹均匀，将涂片面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥；
② 初染：用结晶紫染色1min—2min后用蒸馏水冲洗至洗出液为无色再将涂片面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥；
③ 媒染：用碘液媒染约1min后用蒸馏水洗干净再将涂片面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥；
④ 脱色：用95％乙醇脱色20s—30s后用蒸馏水洗干净再将涂片面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥；

⑤ 复染：用沙黄复染约2min左右后用蒸馏水洗干净再将涂片面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥；
⑥ 镜检：最后在显微镜下用油镜观察，判断菌体染色反应性。
4、2 血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上接种到5mLBHI中，36℃±1℃培养18h～24 h。
取冻干兔血浆 1支加入0、5mL灭菌生理盐水，充分溶解，再加入 BHI 培养物 0、2 mL～0、3mL摇匀，置 36℃±1℃培养箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积得一半，被判定为阳性结果。
5 结果与报告：
5、1 结果判定：符合4、3，5、1与5、2，可判定为金黄色葡萄球菌。
5、2 结果报告：在 25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。
6 注意事项：
6、1 一般干粉培养基应密封保存于阴凉干燥处，Baird-Parker倾到好得平板应在48h内使用。其她配制好得药品无特殊要求可直接保存于冰箱中。
6、2 买来得血平板需放到冰箱中2℃—8℃避光冷藏存放。
6、3 划线接种时，接种环烧红为灭菌彻底。前增菌以后得工作需在生物安全柜中进行。
6、4 在实验过程中若有菌液不慎洒出先用75%酒精棉球擦拭干净，实验完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并应定期对无菌室进行清洗消毒。
6、5 已经开袋得均质袋应保存于无菌室内，并尽快使用，避免污染。
6、6 将已挑取菌落平板保存于2～5℃得冰箱内，至少保留24h以备必要时复查。
6、6 废弃得培养液与培养基需经高压灭菌锅121℃灭菌30min后再废弃或清洗。
6、7 脱色就是革兰染色操作得关键环节，以免脱色不完全造成假阳性；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般为20s—30s。
7、备注
本方法参考国标GB4789、10-2010。

阪崎肠杆菌得测定
1 设备与材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其她设备与材料如下：
1、1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，44 ℃±0、5 ℃，25 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。
1、2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
1、3 恒温水浴箱：44 ℃±0、5 ℃。
1、4 天平：感量 0、1 g。
1、5 无菌吸管：1 mL（具 0、01 mL 刻度） 、10 mL（具 0、1 mL 刻度）。
1、6 无菌培养皿：直径 90 mm。
1、7 无菌锥形瓶：容量100 mL、1000 mL。
1、8 无菌均质袋：尺寸180×320×0、09
1、9 精密 pH 试纸。
1、10 接种环。
1、11矿物油（液体石蜡）。
1、12 无菌吸管。
1、13氧化酶测定试剂盒。
1、14 API 20E试条。
2 培养基与试剂
2、1　缓冲蛋白胨水（buffer peptone water，BPW）：
制法：称取20g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、2±0、2，121℃高压灭菌15min后取出。
2、2　改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose
broth-vancomycin medium，mLST-Vm）：
制法：称取64、6g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至6、8±0、2，121℃高压灭菌15min后取出。临用前每100mL基础无菌加入P-08B万古霉素1支，共配制3个100mL。
2、3　阪崎肠杆菌显色培养基：
制法：称取45、33g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、3±0、2（25℃），121℃高压灭菌3min后取出，冷却至50℃铺制平板备用。

2、4　胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA）：
　　制法：称取38g于1L蒸馏水中，用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸调节PH至7、3±0、2，121℃高压灭菌15min后取出，冷却至50℃铺制平板备用。
2、5 API 20E试条
2、6 0、85%氯化钠培养基：
制法：称取8、5g于1L蒸馏水中，121℃高压灭菌30min、
2、7 无菌蒸馏水
3 操作步骤
3、1 前增菌
3、1、1 固体与液体：取三个检样各100 g（mL）加入已预热至 44 ℃装有 900 mL 缓冲蛋白胨水得均质袋中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36 ℃±1 ℃培养 18 h±2 h。
3、1、2 物体表面：将检样混匀后，于36 ℃±1 ℃培养 18 h±2 h。
3、2 增菌
3、2、1 固体与液体：移取 10 mL 转种于100mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0、5 ℃培养 24 h±2 h。
3、2、2 物体表面：移取1 mL 转种于10mL mLST-Vm 肉汤，44 ℃±0、5 ℃培养 24 h±2 h。
3、3 分离
3、3、1 轻轻混匀 mLST-Vm 肉汤培养物，各取增菌培养物1环，分别划线接种
于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。
3、3、2 挑取 1 个～5 个可疑菌落（蓝绿色），划线接种于 TSA 平板上。25 ℃
±1 ℃培养18-24h用于氧化酶试验得测定，培养48 h±4 h用于生化鉴定中其她试验得测定。
3、4鉴定
3、4、1氧化酶试验（OX）：拿住安瓿瓶中间，轻按将安瓿瓶压破，准确加1滴试剂到空白纸片上（如称量纸），用无菌塑料吸管挑取TSA平板上黄色可疑菌落与纸片得试剂中，观察结果，结果根据以下结果判读表判读。
3、4、2 API 20E试条得接种：自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落与5mL0、85%氯化钠培养基中制成菌悬液备用。在API 20E培养盘中加入约5mL无菌蒸馏水与盘得蜂窝小凹中，

造成一个湿室。将试条置于盘中用无菌吸管加入菌悬液，其中：CIT、VP与GEL小管菌液需充满管部与杯部，其它管仅充满管部；在试验ADH、LDC、ODC、H2S、URE小杯内加入矿物油以形成厌氧环境。盖上培养盒，于36℃±2℃孵育18-24h、
3、4、3 氧化酶试验与API 20E试条得判读：孵育后根据以下结果判读表判读各反应结果。
结果判读表
试验
结果
备注
阴性
阳性
ONPG
无色
黄色（1）
出现浅黄色应立即判定为阳性结果
ADH
黄色
红/橙色（2）
孵育36-48后，出现橙色应判为阴性结果
LDC
黄色
橙色（2）
孵育36-48后，出现橙色应判为阴性结果
ODC
黄色
红/橙色（2）
孵育36-48后，出现橙色应判为阴性结果
CIT
淡绿/黄
兰绿/兰（3）
读小杯顶部得结果（需氧）
H2S
无色/微灰
黑色沉淀

URE
黄色
红/橙色（2）
孵育36-48后，出现橙色应判为阴性结果
TDA
黄色
深褐
滴加TDA立即观察结果
IND
无色/浅绿/黄色
粉红
滴加JAMES立即观察结果
VP
无色
粉红/红色（4）
10-12分钟内出现浅粉红色应判为阴性结果
GEL
黑色素不扩散
黑色素扩散
扩散现象很明显
GLU
兰/兰绿
黄色

MAN
兰/兰绿
黄色

INO
兰/兰绿
黄色

SOR
兰/兰绿
黄色

RHA
兰/兰绿
黄色

SAC
兰/兰绿
黄色

MEL
兰/兰绿
黄色

AMY
兰/兰绿
黄色

ARA
兰/兰绿
黄色

OX
无色
紫色
在10-30秒内出现紫色判为阳性，延迟反应或无颜色改变为阴性

3、4、4判读结果处理：如果加入附加试剂前GLU、TDA、IND、VP等试验阳性结果得数量少于3个，则先记录其她试验得结果于报告单上，不要加任何试剂重新培养24h±2h后，加入附加试剂记录结果（其中TDA试验滴加1滴TDA试剂立即观察结果； VP试验滴加1滴VP1与1滴VP2试剂，等待10分钟判定结果；IND试验滴加1滴JAMES试剂，立即观察结果）。每3个试验为一组，每个阳性试验分别赋予1、2、4，在每组中，阳性反应以相应得数值相加，由此可得到一个7位数字得编码，由API20软件可查出阪崎得可疑百分数。
4 结果与报告
综合菌落形态与生化特征，固体与液体报告每100g（mL）样品中检出或未检出阪崎肠杆菌，物体表面报告检出或未检出。
5 注意事项：
5、1 一般干粉培养基应密封保存于阴凉干燥处，阪崎肠杆菌显色培养基干粉培养基于30℃以下干燥避光保存，制备好得平板于2～8℃避光保存，其她配制好得药品无特殊要求可直接保存于冰箱中。
5、2划线接种时，接种环烧红为灭菌彻底。前增菌以后得工作需在生物安全
中进行。
5、3在实验过程中若有菌液不慎洒出先用75%酒精棉球擦拭干净，实验完后用3%甲酚皂溶液擦拭消毒。并应定期对无菌室进行清洗消毒。
5、4已经开袋得均质袋应保存于无菌室内，并尽快使用，避免污染。
5、5将已挑取菌落平板保存于2～5℃得冰箱内，至少保留24h以备必要时复查。
5、6废弃得培养液与培养基需经高压灭菌锅121℃灭菌30min后再废弃或清洗。
5、7氧化酶试验中不得选用在固体培养基上培养超过48h得菌落，滴加得试剂必需就是1滴，菌落得挑取不得用铁（镍络合金）得物品挑取可疑菌落，可疑菌落应使用固体培养基TSA上培养18-24h得菌落。试剂开启12h后剩余得试剂应弃去。试剂可在18-25℃储存，不要冷冻，需避光。
5、8 API 20E试条必需置于培养盘中用盒盖好才可培养，否则菌悬液会被蒸发，无法判

定结果。需滴加矿物油得试验管应将矿物油加满杯部。开启铝袋后得试剂条应用封口夹
封好2-8℃储存，有效期为10个月。
5、9 API 20E试条附加试剂滴加时IND试验必须最后