紫外可见分光光度法课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,第一节 基本原理,一、紫外,-,可见吸收光谱（,UV-VIS,光谱）,紫外,-,可见分光光度法,起源：价电子能级跃迁,由于分子吸收紫外,-,可见光区的电磁辐射，分子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。,紫外光谱,又称为,电子光谱,分子吸收光谱,问题,1,：,为何,UV-Vis,光谱吸收带都比较宽,?,2,解答,分子吸收紫外可见光时，不仅会引起电子能级的跃迁，振动能级和转动能级同时会发生跃迁。振动能级的间隔要比电子能级的间隔小很多，转动能级间隔更小。这样对于某一电子能级的跃迁，由于同时伴随着振、转能级的跃迁，吸收光子的频率就不是唯一的了，而是很多非常相近的频率,分布在一个较大的频率范围内。,在仪器的分辨率不是特别高时，,这些频率就看起来是连续的，,从而形成带状光谱。,3,吸收带,跃迁类型,官能团,l,max,e,R,带,n,p,*,杂原子不,饱和基团,300nm,200nm,10,4,B,带,分子振动,转动能极,苯环,256nm,200,E,带,p,p,*,苯环大,p,键,E,1,:180nm,E,2,:200nm,4.7,10,4,7000,二、吸收,带,问题,2,：当溶剂极性增大时，为何,K,带和,R,带的间距减小,?,6,仪器校正,1,、波长校正,苯的吸收峰校正波长,（紫外光区）。在,25ml,容量瓶内，滴入一滴苯,(A.R.),，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在,200,280nm,间用,lcm,石英池测定吸收度。,如下：,229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4,精 度,(nm)3.0 3.0 3.5,重现性,(nm)0.15 0.15 0.20,2,、吸收池的校正,：,配对,（两个吸收池,T,差值,T,0.5%,）,第二节 紫外可见分光光度计,7,4,、吸收度的准确度校正,精密称取在,120,干燥至恒重的,重铬酸钾,基准试剂,0.2g(,称准至,0.lmg),，置,500ml,容量瓶中，用,0.02mol/L H,2,SO,4,液溶解，并稀释至,500ml,，摇匀（贮备液）。取,4m1,贮备液稀释稀释,25ml,容量瓶中,(64mg/L,），在规定的波长处测定并计算其吸光系数，并与规定的吸光系数比较，应符合下表中规定。,波长（,nm,）,235,（最小）,257,（最大）,313,（最小）,350,（最大）,吸光系数,的规定值,124.5 144.0 48.62 106.6,吸光系数,的,许可范围,123.0125.0 142.8146.2 47.050.3 105.6108,3,、杂散光校正：,1.2%,KCl,溶液，,H,2,O,空白，,200nm,；,T,1.0%,试剂 浓度,%,（,g/ml,）测定用波长（,nm,）透光率（,%,）,氯化钾,1.20 200,1.0,碘化钠,1.00 220,0.8,亚硝酸钠,5.00 340,0.8,5.,吸收值精度和仪器线性范围,精密称取在,120,干燥至恒重的重铬酸钾基准试剂,0.2g(,称准至,0.lmg),，置,500ml,容量瓶中，用,0.02mol/L H,2,SO,4,液溶解，并稀释至,500ml,，摇匀（贮备液）。用刻度吸管精密量取上述重铬酸钾溶液,1ml,、,2ml,、,3ml,、,、,10ml,分别置于,25ml,容量瓶中，均用,0.02mol,/,L,的,H,2,SO,4,稀释至刻度，摇匀。,(2),测定,：选好配对的,lcm,石英比色池，以,0.02mol/L,的,H,2,SO,4,为空白，选择,S,值，扫描,4m1,贮备液制成的稀释液在,230,360nm,间的,UV,光谱。,(3),将以上,10,种浓度作,A-C,曲线，求回归直线方程。,(4),计算,：根据称样及稀释度，计算,出各个的吸光系数，在直角坐标纸上，以各吸光度为横坐标，相应的吸光系数为纵坐标，绘出吸光系数,-,吸光度曲线。一般来说，仪器测出的吸光系数，在吸光度过小时，常偏高，过大时，常偏低，其间有一段平坦区，在这区间测出的吸光度计算出的吸光系数是一个常数，它与平均值的偏差不超过,0.2,的一段，为这台仪器的线性范围或最佳工作范围。,(1),溶液配制方法,：,9,第三节 定性和定量分析,一、定性分析,二、定量分析,定性鉴别,纯度检查和杂质限量测定,单组分的定量方法,多组分的定量方法,问题,3,下列关于紫外光谱的叙述正确的是,A.,两个化合物相同，其紫外光谱应完全相同。,B.,紫外光谱完全相同的两个化合物，一定是同一化合物。,C.,两个化合物相同，其紫外光谱不一定相同。,D.,紫外光谱完全相同的两个化合物，不一定是同一化合物。,E.,同一种化合物只要是在溶液中测定，则其紫外光谱总,是相同的。,C,相同物质的吸收光谱的特征（,max,、,min,、,sh,等）,相同,，当浓度及测定条件相同时，吸收光谱才相同,11,二、定量分析,（一）,单组分的定量方法,1,、吸光系数法,2,、标准曲线法,3,、对照法：外标一点法,组分,max,溶剂的截止波长,测定波长选吸收最大，干扰最小,12,拓展：导数光谱在中药分析中的应用实例,图,1,陈香白露片中橙皮甙的吸收光谱 图,2,陈香白露片中橙皮甙的导数光谱,1.,橙皮甙,2.,甘草浸膏,1.,橙皮甙,2.,甘草浸膏,3.,其余各组分,+,陈皮中的干扰组分,3.,其余各组分,+,陈皮中的干扰组分,=10nm,中间波长,m1,=274nm,m2,=254.5nm,m=,=274nm,（一）旋光光谱,(ORD),有机化学知识回顾：,具有手性的有机分子和它的镜像是对称的但不能互相重叠。当平面偏振光通过它时，偏振面便发生旋转，即所谓该物质具有,“,旋光性,”,。我们将偏振面所旋转的角度称之为旋光度，可用旋转检偏镜进行测定。从观察者的角度看，当检偏镜,顺时针,方向旋转时，样品称,右旋,(+),物质，,逆时针,方向旋转时称,左旋,(,一,),物质,其他新型光度分析法,手性化合物,旋光镜示意图,平面偏振光,(,即线偏振光,),可看成是以相同的传播速度前进的,左、右两个圆偏振光,的,矢量和,。介质有对称结构时，左旋圆偏振光和右旋圆偏振光的矢量和在同一个平面，是忽长忽短周期性变化的一条线。,旋光现象,图,8-2,平面偏振光和圆偏振光的关系,(a),平面偏振光；,(b),左、右圆偏振光；,(c),平面偏振光由相等的左、右圆偏振光合成,介质为有,不对称,结构的晶体或手性化合物的溶液,(,旋光性,物质,),，如冰晶石或葡萄糖水溶液，左旋圆和右旋圆偏振光在介质中的传播速度不同,(,即折射率不同）使其矢量和偏离原来的偏振面，偏离程度随光程增大而增大,旋光现象,图,8-3,平面偏振光在不对称介质中传播时发生旋转,以不同波长的平面偏振光来测量化合物的比旋光度,并以,或有关量作纵坐标，波长为横坐标,旋光光谱,=(,实,/c,l,)100,常以摩尔旋光度,代替,=,/100,旋光光谱（,ORD,）,1,）无发色团的饱和化合物,旋光值为,负,值的化合物，,ORD,谱线从紫外到可见区呈单调,上升,；旋光值为,正,的化合物是单调,下降,。两种情况下都趋向和逼近,0,线，但不与,0,线相交，即谱线只是在一个相内延伸，没有峰也没有谷,正常,的或平坦的旋光谱线,紫外和可见区的,ORD,图,8-4 (+),和,(-),丁醇,-2,的,ORD,谱线,2,）发色团,(,如羰基,),R,带：,270 nm,。,ORD,曲线在此处越过零点，进入另一个相区。形成的一个峰和一个谷组成的,ORD,谱线,Cotton,效应谱线,正的,Cotton,效应,：当波长由长波一端向短波一端移动时，,ORD,谱线,由,峰向谷,变化,负的,Cotton,效应,：,ORD,谱线由,谷向峰,变化,ORD,谱线与零线相交点的波长称为,K,图,8-5,樟脑酮,的,ORD,谱线,旋光光度计,2.,圆二色光谱,(CD),2.1,原理,旋光性有机分子对组成平面偏振光的,左旋,圆偏光和,右旋,圆偏光的摩尔吸光系数是不同的，,即,L,R,，,圆二色性。,摩尔吸光系数之差,=,L,-,R,，是随入射偏振光的波长变化,而变化的。以,或有关量为纵坐标，波长,(,紫外可见光区,),为横坐标，得到的图谱就叫,圆二色光谱,(,CD,),。,圆二色性常用摩尔椭圆度,来度量，它与摩尔吸光系数差之间的换算关系式为,通常近似为,2.,圆二色光谱,(CD),2.2,仪器,圆二色光谱计示意图,2.3 CD,的应用,蛋白质,构象研究,中的应用,近年来 人们发现疯牛病、克,-,雅氏病和震颤病等神经退行性疾病是由,Pri on,病蛋白所致，而构象变化在,Pri on,病蛋白的致病因素中起着至关重要的作用。因此，,蛋白质的构象,对其生理功能的研究具有巨大意义。,目前 确定蛋白质构象最准确的方法是,X-,射线晶体衍射，但对结构复杂柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难，二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂，相比之下，圆二色 光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。,1969,年,Greenfiel d,最早用,CD,光谱数据估计了蛋白质的构象。近十几年以来，研究者发现，,近紫外,CD,（,250320 n m,）,作为一种灵敏的光谱探针，可反映蛋白质中,芳香氨基酸残基、二硫键微环境,的变化；,远紫外区,CD,（,178250 n m,）,反映,肽键,的圆二色性。,2.3 CD,的应用,蛋白质构象研究中的应用,2.3.1,蛋白质的圆二色性,在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键，芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。,圆二色性的大小也可用摩尔椭圆度,来度量,近似为,2.3 CD,的应用,蛋白质构象研究中的应用,2.3.2,蛋白质的远,UV CD,二级结构,-,螺旋结构在靠近,192 n m,有,一正的谱带,在,222,和,208 n m,处,表现出两个负的特征肩峰谱带,;,-,折叠的,CD,谱在,216 n m,有一,负谱带,在,1852 00 n m,有一正谱,带,;,-,转角在,206 n m,附近有一正,CD,谱带，而左手螺旋,P2,结构在,相应的位置有负的,CD,谱带。因此，,根据所测得蛋白质或多肽的远紫,外,CD,谱，能反映出蛋白质或多肽链二级结构的信息。,2.2.3,蛋白质的远,UV CD,三级结构,全型,+,型和,/,型蛋白在,222,n m 和,2,08n m,都表现出明显的负峰,，,而在,190,195n m,内,都有正,峰,。,全,型蛋白的正,、,负,CD信号交叉在低于,17,2,n m 波长,处,，,若交叉发生在更高的波,长位置,，,则很可能是含有型结构,。据,此可,区别,全,型,+型和/,。,图,2,b 中型的溶菌酶和,核糖核酸酶A及图,2,c 中/,型的丙糖磷酸异,构酶,、,黄素氧化还原酶,、,枯草杆菌蛋白酶BPN,的,正,、,负,CD 信号交叉都发生在高于17,2,n m 波长处,。,比较图,2,b 和,2,c 的差别可发现,，222,n m 和,2,08 n m,两处的CD 数据能区分+型和/两种不同,类型的蛋白质,。,+类型的蛋,白质,2,08 n m比,222,n m 的CD 值要大,，,而/型蛋白 的CD谱,特征正好相反,。而,全 型蛋白缺乏象-螺旋,那样明显的CD 特征,。,图,2,d 和,2,e 中,前血清蛋白,和,-糜蛋白酶等全 型结构的蛋白表现出不同,的CD 谱峰特征,。,1,）,紫外可见区域，用不同波长的左、右旋圆偏振光测量,CD,和,ORD,的主要目的是研究有机化合物的构型或构象。在这方,面，,ORD,和,CD,所提供的信息是等价的。,2,）,200,800 nm,内无特征吸收，,ORD,呈单调平滑曲线，,CD,近于,水平直线,。,3,）,200,800,nm,内有特征吸收，则,ORD,和,CD,都呈,Cotton,效应,4),当,ORD,呈正的,Cotton,效应时，相应的,CD,也呈正的,Cotton,效应,5),理想情况下，,UV,吸收峰,max,、,CD,的,绝对值最大对应波,长,(,呈峰或谷处,),及,ORD,的,K,三者应相等,6)cotton,效应的正、负与化合物中靠近生色团的手性中心的构型,有密切的联系，在一定条件下可将不对称分子中某生色团吸收,峰的,Cotton,效应的正、负号与该生色团附近的手性中心的构型,联系起来。,旋光光谱、圆二色光谱、紫外光谱之间的关系,图,8-7,ORD、CD,与UV谱线的关系,图,8-8 旋光谱(上)和圆二色光谱(下)与右旋发色团(a)和左旋发色团(b)对应关系,图,8-9,1R-(+)-2-苯骈降冰片的,CD和UV谱,正的,CD,谱相应于,R,带,UV,光谱的应用,DNA,与药物相互作用研究进展,DNA,分子在,260 nm,附近处有强吸收，可根据相互作用前后,DNA,或其他分子的吸收谱带的变化对二者相互作用模式进行判断。,(1),如导致分子的构象变化对于,UV,来说，则,DNA,的吸收光谱产生,减色效应,及,红移现象,；如破坏了,DNA,双螺旋结构，则产生,增色效应,。,(2),金属配合物等分子与,DNA,发生嵌插作用，则该分子的吸收光谱峰出现,减色效应,和,红移现象,；如该分子与,DNA,发生静电作用或沟槽作用,则光谱峰出现较小的,红移,，且减色效应不明显,。,1,、,UV-VIS,法,2,、,圆二色光谱,（CD,）法,圆二色光谱,(CD),是以高频变换的左旋或右旋偏振光为入射光，根据结合了小分子和没有结合小分子的,DNA,在,260 nm,处的吸收的改变得到有关其结构的信息或对一些本身没有,CD,信号，但在与,DNA,结合后能产生诱导,CD,的分子，也可得到其结构的信息。,甲萘威(carbaryl)虽然本身无明显的致癌作用,但是其与亚硝酸盐联合作用时就具有致癌、致畸及诱变作用,。通过紫外光谱法研究了甲萘威与,DNA,的相互作用,.,结果显示,在甲萘威的作用下,DNA,的吸收光谱出现增色与红移现象。实验结果支持甲萘威能以嵌插方式与,DNA,形成加合物。,应用实例,1,：光谱法研究甲萘威与,DNA 的相互作,用,1.,紫外可见吸收光谱,图1为模拟生理条件下,，,大黄酸,UV,吸收光谱及大黄酸一BSA体系的,UV,吸收差谱。由图可见，大黄酸220,nm,处吸收峰强度有规律地降低并且峰位发生红移。说明大黄酸与BSA之,间,有显著的相互作用，同时也说明它们的相互作用使该共轭体系的能级发生了明显的变化,。,应用实例,2,：光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的 相互作用,光谱学与光谱分析,2011,31(9):2446-2449,2,.,圆二色谱法,为研究大黄酸与BSA作用过程中BSA二级构象的变化，,对比测试了B,S,A及大黄酸-BSA体系的圆二色谱。,由图,5,看出,应用实例,2,：,光谱及电化学方法研究大黄酸与牛血清白蛋白的相互作用,b和C的CD波谱相对于a有,明显的,红移,现象，表明,大黄酸,与,BSA,结合,改变了BSA空间构象,。,概念,：在溶液中加入表面活性剂，不仅增溶，更重要,的是增大传统分光光度法的灵敏度。,特点：,摩尔吸光系数增大，峰红移,高配位、多元络合物，分子截面积,a,大,0.8710,20,pa,光吸收强度与整个光谱带的积分吸收强度有关,max,与截面积有关，也受半峰频宽的约束,（一）,胶束增溶分光光度法,第四节 拓展：其他新型光度分析法,能显著降低水的表面张力,的物质为表面活性剂,Surface Active Material,表面活性剂,-,概念,非表面活性剂,无机盐，蔗糖，甘露醇,非表面活性剂,醇，醛，酸，酯,表面活性剂,肥皂浓度在,0.2%,时,表面张力降至,40,分子结构：,两亲分子,亲水基,hydrophilic group,憎水基,hydrophobic group,离子与非离子型,表面活性剂,-,分类,阳离子型,伯仲叔季胺盐，烷基吡啶,阴离子型,羧、磺酸盐，硫、磷酸酯盐,两性型,氨基酸、甜菜碱型,非离子型,聚氧乙烯、多元醇型,表面活性剂,-,C.M.C.,胶束的形成,C.M.C.,Critical Micelle Concentration,形成胶束所必需的最低浓度,胶束增溶作用,形成胶束后，难溶物水中溶解度显著增大。,微环境,不同,含不溶性脂肪醇的烷基硫酸盐溶液稀释，变浑浊,拟均相萃取,埃铬菁,R,Be,2,(pH6.9),C.M.C.,以上的,Zeph,存在，增敏,Zeph,氯化十四烷基二甲基苄基铵,埃铬菁,R,胶束增溶分光光度法,-,实例,胶束增溶分光光度法,-,实例,有,Zeph,595nm,最大,Be:ECR=1:1,无,Zeph,522nm,最大,Be:ECR=1:2,胶束增溶分光光度法,-,非离子型,表面活性剂的,增溶,/,增稳,/,增敏实例,金属双硫腙体系,传统：用,CHCl,3,或,CCl,4,萃取,Triton X-100,增溶,水相直接测定铜锌等,对,-(1,1,3,3,-,四甲基丁基,)-,苯基醚,Fe(III),SCN,体系,分级络合，还原退色，,10m,退,10,加,Triton X-100,灵敏度提高,1,倍，,12h,稳定,（二）流动注射分光光度法,优点：分析速度快、准确度和精密度高、节省试剂和样品、可与各种检测技术、分离技术结合。,广泛应用于快速分析、过程分析及在线分析。,2.,2.,2.,2.,（二）流动注射分光光度法,流动注射分析方法的发展,1.1,连续流动分析技术,连续流动分析技术,(,continuous flow analysis,，,CFA,),是基于在管道中将连续流动的试样溶液用空气按一定的间隔,规则地隔开，然后按顺序和比例混入试剂溶液，在通过混合,圈的过程中完成反应，除去气泡后，进入检测器。这种技术,采用空气间隔能有效地防止各段试样间的相互混合，因此它,曾在,自动分析领域,中得到广泛应用，但气泡的存在会带来许,多问题。,（二）流动注射分光光度法,流动注射分析方法的发展,1.2,流动注射分析技术,流动注射分析技术(flow injeetion analysis，FIA),是在连续流动分析技术基础上发展起来的。它是一种在,没有气泡间隔的条件下进行分析的方法。传统的流动注射,分析系统是由多通道蠕动泵、注入阀、反应管、检测器,(如分光光度计)及记录仪组成。根据峰形信号与被测物,浓度具有的相关性，利用峰面积或峰高可对被测物质进行,定量分析。,（二）流动注射分光光度法,流动注射分析方法的发展,1.3,顺序注射分析技术,1990,年，,RUZICKA,和,MARSHALL,在流动注射分析的基础,上发展了一个流动注射分析的新分支,顺序注射分析,(sequential injection analysis,，,SIA),。顺序注射分析系统,的核心部分是多通道选择阀，此阀的各个通道分别与检测器、,样品、试剂等通道相连，通过泵的作用，顺序从不同的通道吸,入一定体积的区带于泵与阀之间的储存管中，在此过程中，试,剂与试样由于径向扩散和轴向对流作用混合，一定时间后，将,其推至检测器测定。顺序注射分析的突出优点在于，它可以用,同一装置完成不同项目的分析而无需改变流路设置。,（二）流动注射分光光度法,流动注射分析方法的发展,1.3,流动注射一可更新表面技术,流动注射一可更新表面技术,(flow injection renewable,surface teehnique，FI-RST)或微珠注射技术(bead iniection，,BI)是,流动注射微量分析的第3代技术。同样具有多通道选择,阀，只是用微珠作为试剂的载体，试样与试剂在微珠表面反,应并实时记录，反应结束后，系统将微珠自动排废。,FI-RST,以微珠作为微载体进行溶液处理，自动表面更新后操作，消,除了顺序注射分析中出现的分析过程中混合试剂之间的相互,影响，而且也提高了分析的灵敏度,。,（二）流动注射分光光度法,流动注射分析方法的发展,1.4,微全分析系统,微全分析系统,(micro total analysis systems),概念的提出，特,别是微流控芯片的发展，使流动注射分析系统走向微型化。它,采用微加工方法在平板上制作出微米级结构，由计算机控制试,样和试剂在这些微结构中的流动、分散、混合及反应过程，是,目前集成程度和自动化程度最高的流动注射分析系统。已在环,境分析、生命科学及食品分析等领域显示出巨大的优越性,。,（二）流动注射分光光度法,2.,流动注射分析与其他分析方法的联用技术,可与分光光度法、原子光谱法、电化学分析法、发光分析法、,电感耦合等离子体原子发射光谱法,(1CP-AES,）、生物传感,器、毛细管电泳、免疫分析法等技术联用，构成完整的分析,系统。,流动注射,-,分光光度法,(,flow injection-spectro-photometry,，,FI-S,),是应用最普遍的一种联用技术。该方法简便，价格低廉，,可以方便地与信号处理系统连接。广泛应用于环境监测、水质,重金属检测、食品安全监测、药物分析等领域。,（二）流动注射分光光度法,3.,流动注射分光光度法在药物分析中的应用,流动注射可分为,正相流动注射分析,(FIA),和反向流动注射分析,(r-FIA),，,一般的,FIA,是指正相流动注射，即将试样注入阀内与流动的试剂混合的测定,方法。而,r-FIA,是将试样与试剂的位置对调，灵敏度高于,FIA,，而且节省试,剂，常用于流动注射分光光度法中。,例：,2007,年，,Vanessa G K Almeida,等采用了,r-FIA,紫外,-,可见分光光度法测,定抗利什曼虫的中锑的含量。灵敏度高，其检测限可达,29 ngmL,，检测速,度达到,63,次每小时。,Marcos Grtinhut4,等建立了,r-FIA,紫外,-,可见分光光度法,测定了尿样中酚类化合物的量，检测限为,7.7 mg/L,，相对标准偏差为,0.9,。,Kleszczewski,等采用流动注射,-,分光光度法利用维生素,C,具有还原性的性质测,定人血清中维生素,c,，分析速度快、操作简单、灵敏度高，节约试剂等。,Corominas,等 建立了,FIA,紫外,-,可见分光光度法测定药物制剂中的青霉胺、,异丙嗪和甲哌氟丙嗪，分析速度快,(70,个每小时,),。,（二）流动注射分光光度法,4.,流动注射分光光度法在药物分析中的发展,FIA,紫外一可见分光光度法与各种在线分离富集、转化技术相结合，,如,微波、多流路切换技术、离子交换柱、动力学分析技术,等，不仅可以,进行多组分的测定，而且可以进行价态分析，提高分析的灵敏度和选择性。,微波流动注射技术,解决了慢反应过程的测定问题，微波场能够强烈加快,金属离子的反应速度，由于微波对各种化学反应速度的影响不同，因此可,提高方法的选择性和检测的快速性，便于控制和检测。,Huaiwen Wang,建立,了测定微量钌的微波流动注射催化分光光度法，测定出钌的总量。因此将,微波技术与,FIA,相结合（,BISFI,）建立测定微量贵重金属离子的微波,FIA,新,体系具有重要意义。,M J Ruedas Rama,等采用了,BISFIA,同时测定异丙嗪和,三氟拉唑，此法利用三价铁能将酚噻嗪类药物氧化，再通过传感器信号的变,化求出酚噻嗪类药物的含量，此分析方法灵敏度较高，分析速度快。,1971,年瑞典学者,Engvail,和,Perlmann,荷兰学者,Van Weerman,和,Schuurs,分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法,(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),。,1.,定义,酶联免疫吸附测定法,(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA),又称光度酶联免疫法，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。,优势：,灵敏度高、特异性好、检测速度快、检测成本,（三）酶联免疫吸附测定法（,ELISA,）,2.,特点,2.1,可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的反应是一种可逆的动态平衡,Ag+Ab,AgAb,2.2,高灵敏性,由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的灵敏度。,2.3,特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。,（三）酶联免疫吸附测定法（,ELISA,）,3.,测定原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，受检标本和酶标抗原或抗体与固相载体表面的抗原或抗体起反应。,用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。,加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。,三种必要的试剂,固相 的抗原或抗体,酶标记的抗原或抗体,酶作用的底物,（三）酶联免疫吸附测定法（,ELISA,）,3.,特点,2.1,可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的反应是一种可逆的动态平衡,Ag+Ab,AgAb,3.2,特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。因此，在很多时候，测定某一特定的物质不需分离待测物。,3.3,最适比例 只有当抗原抗体的浓度比例是当时，才出现可见反应。以沉淀反应为例（,Ab,量固定，,Ag,量递增）,（三）酶联免疫吸附测定法（,ELISA,）,（三）酶联免疫吸附测定法（,ELISA,）,4.,酶和底物,5.,测定方法,1,）,双抗体夹心法,检测蛋白质等大分子抗原,最常用的方法,将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。,加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。,加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。,加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。采用分光光度法进行该抗原的定性或定量。,5.,测定方法,2,）双抗原夹心法测抗体,反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其灵敏度较。乙肝标志物中抗,HBs,的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,3,）双位点一步法,在双抗 体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的,ELISA,提高到新水平。,5.,测定方法,4,）,间接法,检测抗体最常用的方法，,优点,：只要变换包被抗原就可利用,同一酶标抗抗体建立检测相应抗体。,将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。,加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他抗体及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。,加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人,IgG,抗体。,加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。,5.,测定方法,5,）竞争法,同时适用于检测抗原及抗体,。以检测抗原为例，步骤如下：,将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。,待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。,加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。,6.,应用,应用于生物、化学、医学、食品安全及环境污染检测等领域。,食品中生物毒素,(,微生物毒素、动物毒素、植物毒素,),的检测,1,）,微生物毒素检测,细菌毒素的检测：如肉毒毒素、金黄色葡萄球菌等。,真菌毒素的检测：黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和伏马菌素等。,2,）,动物毒素的检测,麻痹性贝毒,(,贝类中）、河豚毒素,3,）植物毒素的检测,植物蛋白毒素：蓖麻毒素、相思子毒素等,植物非蛋白毒素：疯草毒素等,有机磷农药残留的检测,6.,应用,有机磷农药单残留检测,1968,年，,Centeno E,R,等制备了杀虫剂马拉硫磷的抗血清，并通过抗原抗体凝集反应证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性，这标志着免疫学检测技术正式应用于农药残留检测中。,1975,年，,Langone,等建立了狄氏剂和艾氏剂的竞争性,RIA,，检测极限分别为,50 pg,mL,和,2 ng,mL,，这是,RIA,在农药领域的首次应用。,1977,年，,Ercegnvich,和,Mumma,成功开发了对硫磷的免疫化学分析法。,1980,年，,Hammock,和,Mumma,进一步探讨了农药免疫化学分析方法的理论和技术问题之后，农药残留免疫化学分析技术的发展进入了一个崭新的阶段。,1998,年，,Amin M,R,等用,ELISA,对草甘磷进行了分析。,2003年，Lee JK等对乙酰甲胺磷的ELISA方法进行了深入的研究,最低检出限达到2ngmL,