药物代谢-LCMS在药物分析中的应用-代谢产物鉴定.ppt

<p>,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,L o g o,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,L o g o,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,药物代谢 LCMS在药物分析中的应用-代谢产物鉴定,质谱技术与诺贝尔奖,If the periodic table is the“alphabet”of chemistry,then molecules are“words”,and chemical reactions and interactions are“sentences”.,One important tool to observe the language of chemistry is liquid chromatography/mass spectrometry(LC/MS).,2,质谱原理简介,质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的棒图就是我们常见的质谱图。,常见术语,质荷比,:,离子质量,(,以相对原子量单位计,),与它所带电荷,(,以电子电量为单位计,),的比值,写作,m/z,(mass-to-charge ratio).,峰,:,质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰,.,离子丰度,:,检测器检测到的离子信号强度,.,基峰,:,在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰,.,总离子流图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子,质谱,检测,回答分析化学中最常见的问题,定性-样品中有什么,?,定量-样品中有多少,?,MS:Mass Spectrometry,6,大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,质谱仪的特点,真空系统,样品入口,检测器,数据系统,质量分析器,离子源,大气,atmospheric pressure ionization,离子源 离子生成,质量分析器 离子分离,检测器 离子收集,8,真空对质谱有何重要性？,低真空,高真空,带电离子,检测器,检测器,气体分子,9,离子源,10,色谱,-,质谱联用技术接口（离子化方法）,GC/MS,LC/MS,电子轰击离子化,EI,化学电离离子化,CI,正化学电离离子化,PCI,负化学电离离子化,NCI,大气压离子化,API:atmospheric pressure ionization,电喷雾离子化,(ESI:electrospray ionization),大气压化学电离离子化,(APCI:atmospheric pressure chemical ionization),大气压光电电离,(APPI:atmospheric pressure photo ionization),11,电喷雾离子化（,ESI,）过程,12,大气压化学离子化（,APCI,）过程,13,ESI,和,APCI,离子化方式对比,生成离子的方式不同：,ESI,：液相离子化；,APCI,：气相离子化,样品兼容性,ESI,：极性化合物和生物大分子,APCI,：非极性，小分子化合物（相对,ESI,而言），热稳定，具有挥发性,流速兼容性,ESI-0.001,到,1ml/minAPCI-0.2,到,2ml/min,ESI,的适用范围要远远大于,APCI,复杂样品分析时，,APCI,相对于,ESI,不易受到基质效应影响,14,哪种离子化方式？,15,质量分析器,16,质量分析器,离子阱质量分析器(,Ion trap,IT),四极杆质量分析器(,Quadrupole,Q),飞行时间质量分析器(,Time-of-flight,TOF),扇形磁场和静电场(,Sector,E&amp;B),傅里叶变换离子回旋共振,(FT-ICR),真空区工作,电场或磁场（控制离子的运行轨道）,根据,m/z,不同，实现离子分离,17,空间上串联质谱,全扫描,选择离子监测,(SIM),产物离子扫描,选择反应监测,(SRM),母离子扫描,中性丢失扫描,定量分析,三重四极杆串联质谱仪（,triple-quadrupole,tandem MS,）,四极杆,18,四级杆质量分析器,Resolution,：,Low,unit,Mass range:25-2000 u,Scan speed:4000 u/sec max,Vacuum requirement:10,-4,10,-5,Torr,19,质量分析器性能指标,M.Holcapek et al./J.Chromatogr.A,1259(2012)3 15,分辨率：是指质谱仪分开相邻质量数离子的能力，一般定义是：对两个相等强度的相邻峰，当两峰间的峰谷不大于其峰高,10%,时，则认为两峰已经分开，其分辨率为,其中,m1,和,m2,为质量数，且,m1m2,故在两峰质量数差别越小时，要求仪器分辨率越大,20,Resolution example,Q1,要鉴别化合物,A(,m/z,为,235.1077,，,C,12,H,14,N,2,O,3,),和,B(,m/z,为,235.0713,，,C,11,H,10,N,2,O,4,),两个峰，仪器的分辨率至少是多少？,21,离子阱质量分析器（,IT,）,时间上串联质谱,全扫描,选择离子监测(,SIM),产物离子全扫描,选择反应监测(,SRM),多级全扫描（,n=3,10),定性分析,22,离子阱质谱仪（,IT,）,Resolution,：,Low,unit,Mass range:4000 u,Scan speed:4000 u/sec,Vacuum requirement:10,-3,Torr,23,四极杆,-,飞行时间质谱,(Q-TOF),杂交质谱,全扫描,选择离子监测,产物离子扫描,准确分子量测定（元素组成）,生物大分子检测,定性分析,24,Resolution,：,high,Mass range:unlimited,Scan speed:10,6,u/sec,Vacuum requirement:10,-7,Torr or greater,飞行时间质谱仪,25,质谱扫描模式,26,扫描模式,Full Scan,（全扫描）,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Full scan(Q1),Full scan(Q3),=scanned;,=selected m/z;,blank=complete transmission,可获得丰富的谱图信息,复杂样品中成分鉴定,27,扫描模式,母离子扫描,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Precursor Scan,=scanned;,=selected m/z;,=CID,适合于含有相同局部结构（碎片离子）的一类化合物的鉴定,28,扫描模式,产物离子扫描,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Product Ion Scan,=scanned;,=selected m/z;,=CID,适合于化合物官能团分析以及化合物的结构解析,29,扫描模式,中性丢失,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Neutral Loss Scan,=scanned;,=scanned with offset;,=CID,选择性获取丢失某一固定碎片的化合物信息（鉴定二相结合代谢物）,30,扫描模式,SIM,（选择离子监测）,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Selected ion monitoring(SIM)(Q1),Selected ion monitoring(SIM)(Q3),=scanned;,=selected m/z;,blank=complete transmission,当全扫描无法满足灵敏度的要求时,适合于基质不是很复杂的样品的定量分析,31,扫描模式,SRM/MRM,（选择,/,多级反应监测）,MS Mode,Q1,Q2,Q3,Selected/Multiple reaction monitoring(SRM/MRM),=scanned;,=selected m/z;,=CID,SRM&amp;MRM,适合于较脏、基质复杂的样品，提高选择性和灵敏度,定量分析,32,质谱图的样子?,33,质谱图的样子,(APCI/ESI+),34,质谱图的样子,(APCI/ESI+),35,质谱图的样子,(APCI/ESI+),36,质谱图的样子,(APCI/ESI+),37,质谱图的样子,(ESI+),38,质谱图的样子,(APCI/ESI,),39,质谱图的样子,(APCI/ESI,),(B)M,H,M-H+CH3COOH,40,软电离模式常见前体离子类型,41,质谱图和色谱图,?,42,色谱图?,如果我们注意这个区域.,1.25,1.50,1.75,2.00,2.25,2.50,2.75,3.00,3.25,Time,50,100,%,TIC,43,色谱图-放大,在此的细微观察是由许多点组成的,.,2.12,2.14,2.16,2.18,2.20,2.22,2.24,2.26,2.28,Time,78,100,%,TIC,44,质谱图,每个点相对于质量分析器的一个扫描,(,质谱图,).,60,80,100,120,140,160,180,200,220,240,260,280,300,0,100,%,240,241,45,色谱图上的质谱图,每个点有一张唯一的质谱图,46,数据观察-色谱图,样品运行中的每秒我们可获得一张或数张质谱图,通常是把检测到的离子叠加在一起获得一个唯一的总的数值,这些总的数值然后排列在一起,(,点对点,),产生一个总离子流色谱图,(,TIC).,47,总离子色谱图(,total ion current,TIC),每次扫描加和所有的离子得到,.,48,数据观察-色谱图,我们也能显示单个离子的色谱图和质谱图,这让我们得到一个化合物的信息,49,数据观察-选择离子色谱图,TIC,图上显示的两个接近的流出峰，每个峰是具有不同质谱指纹的不同化合物,.,11.00,12.00,Time,0,100,%,TIC,1.57,e5,50,数据观察-选择离子色谱图,100,200,300,400,500,600,m/z,0,100,%,254.2,194.2,507.3,334.3,399.7,100,200,300,400,500,600,m/z,0,100,%,194.2,580.4,402.2,226.2,460.2,11.00,12.00,Time,0,100,%,TIC,1.57,e5,51,分离共流出物峰,10.50,11.00,11.50,12.00,12.50,Time,0,100,%,0,100,%,0,100,%,254.23,5.81,e4,194.20,6.14,e4,TIC,1.57,e5,m/z,254,m/z,194,TIC,Extracted ion chromatogram(XIC or EIC),52,选择离子色谱图,筛选离子能给出更好的信噪比,消除背景影响,分离共流出物峰,筛选离子也能用于,:,色谱峰的跟踪,准确定量,53,数据观察-选项,总离子流色谱图（,TIC）,观察所有可见峰的最好方法,选择离子色谱图（,XIC）,观察某一化合物的最好方法,54,LC/MS,不同扫描方式,全扫描总离子流色谱图,从,TIC,图中提取离子色谱图,产物离子扫描色谱图,选择离子监测色谱图,选择反应监测色谱图,m/z,100-500,m/z,298 from TIC,MS,2,of,m/z,298,SIM,m/z,298,SRM,m/z,298,180,55,LC/MS,在药物代谢研究中的应用,56,药物代谢研究常用的分析技术,放射性同位素分析,代谢物追踪；组织分布；质量平衡,液相色谱,-,串联质谱分析,代谢物发现和表征；多级质谱；高分辨质谱,核磁共振分析,代谢物对照品结构解析,57,LC/MS/MS,成为药物代谢研究的主要工具,生物样品定量分析,LC/MS/MS,-,三重四极杆,LC/UV,免疫分析,其他技术,代谢物鉴定,LC/MS/MS,三重四极杆,离子阱,高分辨,MS,NMR,和其他技术,58,药物代谢产物鉴定一般流程,产生代谢物,分离代谢物,检测代谢物,药物,体外孵化（肝细胞、微粒体、重组酶）；生物样品（动物或人用药后）,提取和纯化代谢物，例如通过沉淀蛋白、液液提取、固体萃取和微透析,与空白样品色谱对照，检测,LC/MS,总离子色谱或,HPLC/UV,色谱中新出现的色谱峰,通过中性丢失和前体离子扫描以及通过特征离子检测可能的代谢产物,采用,LC/,高分辨质谱，通过,MDF,或背景扣除筛选可能的代谢产物,液相色谱,-,放射活性检测器，检测放射标记的代谢产物,59,表征代谢物,药物代谢产物鉴定一般流程,比较母体药物和代谢产物的产物离子质谱,通过,MS/MS,或,MS,n,检测结构特征性离子,通过测量准确质量确定代谢产物的分子式组成,互补性质谱分析（正、负离子切换；不同的电离源）,获得代谢产物对照品（合成、体外代谢孵化、微生物转化、生物样品分离提取等）,比较色谱保留时间和质谱特征,Kostiainen R,Kotiaho T,Kuuranne T,Auriola S.Liquid chromatography/atmospheric pressure ionization-mass spectrometry in drug metabolism studies.,J.Mass Spectrom,.2003;38:357372.,60,代谢反应,质量变化,C,-,羟基化,+16,环氧化,+16,N,-,氧化,+16,N,-,羟基化,+16,S,-,氧化,+16/+32,P,-,氧化,/,羟基化,+16/+17,甲基化,+14,乙酰化,+42,双键还原、羰基还原,+2,杂原子（,O,N,S,）去甲基,-14,氧化脱硫,-32,葡萄糖醛酸结合,+176,硫酸结合,+80,谷胱甘肽结合,+305/+307,甘氨酸结合,+57,谷氨酰胺结合,+145,牛磺酸结合,+107,代谢产物分子量变化,61,阿比朵尔人体内代谢产物鉴定,阿比朵尔是已经上市的广谱抗病毒药物,预防和治疗流行性感冒药，通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒的复制,62,代谢实验方法,两名健康男性志愿者口服,2,粒阿比朵尔胶囊,(200 mg),，收集服药前和服药后,024 h,尿样,部分尿样通过葡萄糖醛酸苷酶水解,分析仪器,Agilent 1200 HPLC system,Agilent 6300 LC/MSD Trap XCT ultra,Waters Acquity UPLC,Waters Q-TOF Synapt,MS,阿比朵尔代谢产物鉴定,63,阿比朵尔的一级质谱图（离子阱质谱仪）,64,阿比朵尔的二级质谱,(,m/z,477),-45 Da,-18 Da,-44 Da,65,-44 Da,-109 Da,阿比朵尔的三级质谱,(,m/z,477,432,),66,-109 Da,-28 Da,-79 Da,阿比朵尔的四级质谱,(,m/z,477,432 388,),67,-44 Da,-28 Da,阿比朵尔的四级质谱,(,m/z,477,432 323,),68,阿比朵尔的质谱解析,Br,N,O,H,Br,N,O,S,O,H,+,N,N,O,S,O,Br,H,O,N,O,S,O,N,O,S,O,H,O,Br,N,S,O,H,O,Br,H,N,H,O,Br,O,O,N,O,C,H,2,O,H,O,Br,N,Br,S,O,H,H,+,N,S,O,H,O,H,N,C,H,2,O,H,O,Br,H,N,C,H,2,O,H,O,Br,H,+,.,N,C,H,2,O,H,O,Br,H,N,Br,C,H,2,O,H,H,+,N,H,O,Br,O,O,m/z 477,m/z 459,+,+,m/z 432,+,m/z 432,+,m/z 388,+,m/z 294,+,.,m/z 323,m/z 279,m/z 360,+,m/z 309,-(CH,3,),2,NH,-45,-H,2,O,-18,-44,-C,6,H,5,S,-109,-C,8,H,10,S,-138,-C,6,H,5,S,-109,-CO,-28,-Br,-79,m/z 294,+,.,m/z 279,-CH,3,CHO,-44,-CH,3,CH,2,-29,+,-CH,3,-15,m/z 264,-CO,-28,m/z 251,.,-CH,3,CHO,.,+,69,通过全扫描质谱分析，检测到,17,个代谢物，包括,5,个一相代谢物和,12,个二相代谢物，它们都含有,79,Br/,81,Br,同位素模式,M1,m/z,463(14 Da),M2,m/z,493(+16 Da),M3,m/z,479(+16 14 Da),M4,m/z,509(+32 Da),M5,m/z,495(+32 14 Da),鉴定人尿中阿比朵尔代谢产物,70,阿比朵尔及其代谢物的液相色谱和多级质谱数据,71,Metabolite identification of arbidol in human urine by the study of CID fragmentation pathways using HPLC coupled with,ion trap mass spectrometry,Yuya Wang,Xiaoyan Chen,Qiang Li and Dafang Zhong,Agilent 1200 HPLC system,Agilent 6300 LC/MSD Trap XCT ultra,Wang YY,Chen XY,Li Q,Zhong DF.,J Mass Spectrom,2008,UPLC-Q/TOF MS,鉴定人体内阿比朵尔代谢物,仪器：,Acquity,超高效液相色谱系统及,Synapt Q-TOF,质谱仪（美国,Waters,公司）。,UPLC-UV,条件：,Acquity UPLC BEH C18(2.150 mm,1.7 m),梯度洗脱。紫外检测波长,316 nm,。,Q/TOF,质谱条件：,ESI,源，正离子检测，喷雾电压为,3.0 kV,；雾化气流量,800 L/h,，去溶剂温度,350,o,C,；离子源温度,100,o,C,；,MS,E,高能量扫描时,Transfer CE,为,15 ev,，,Trap CE,为,1530 eV,；低碰撞能量时,Transfer CE,为,2 ev,，,Trap CE,为,3 eV,。,Metabolynx parameters,受试者尿中阿比朵尔代谢物谱,-,葡萄糖醛酸酶水解前,31,种代谢物,M0,-,葡萄糖醛酸酶水解后,M6,M0,阿比朵尔及其代谢物对照品,阿比朵尔,阿比朵尔砜,N-,去甲基阿比朵尔砜,4,-,羟基阿比朵尔,阿比朵尔亚砜,N-,去甲基阿比朵尔亚砜,阿比朵尔的质谱裂解规律,477.082,-109 Da,-44 Da,-45 Da,m/z,432.022,m/z,388.001,m/z,278.989,M+H,+,/M,+H+2,+,阿比朵尔亚砜的质谱裂解规律,-125 Da,493.078,m/z,368.075,M+H,+,/M,+H+2,+,阿比朵尔及其代谢物对照品的质谱裂解规律,-125 Da,-125 Da,阿比朵尔,阿比朵尔砜,N-,去乙基阿比朵尔砜,4,-,羟基阿比朵尔,阿比朵尔亚砜,N-,去乙基阿比朵尔亚砜,阿比朵尔硫酸酯,-80 Da,-176 Da,阿比朵尔葡萄糖苷酸,结合型代谢产物鉴定,80,受试者血浆和尿中阿比朵尔的代谢产物,阿比朵尔在人体内代谢途径,阿比朵尔及其代谢物的质谱断裂特点,作为化学键均裂的结果，阿比朵尔及其代谢物有共同的断裂模式，这种断裂生成奇电子离子，失去自由基,阿比朵尔、,N,-,去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、,N,-,去甲基阿比朵尔砜的质谱裂解特点是：首先丢失甲胺,(45 Da),然后丢失乙醛,(44 Da),再丢失苯硫自由基,(109 Da),具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基,(125Da),，然后丢失甲胺,(45 Da),和乙醛,(44 Da).,83,阿比朵尔结合型代谢物的质谱断裂特点,阿比朵尔、,N,-,去甲基阿比朵尔、阿比朵尔砜、,N,-,去甲基阿比朵尔砜结合型代谢物的质谱裂解特点是：首先丢失,SO,3,（,80 Da,）或葡糖醛酸（,176 Da,）,具有亚砜结构的代谢物，首先断裂苯亚磺酰基自由基（,125 Da,），然后丢失,SO,3,（,80 Da,）或葡糖醛酸（,176 Da,）,84,结论,液相色谱的良好分离是鉴定代谢产物的必要条件,多级质谱提供了丰富的结构信息,高分辨质谱提供的准确分子量信息有助于代谢产物的快速鉴定,鉴定代谢产物结构还需要,合成或分离代谢物对照品,核磁共振光谱,酶水解,深入理解药物代谢反应和质谱裂解规律,85,</p>