浙大生物化学：RNA的生物合成课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生 物 化 学,第十六章 转录,第一节 模板和酶,第二节 转录装置,第三节 转录过程,第四节 转录后的修饰,转录,转录,（,Transcription,）,生物体以,DNA,为模板合成,RNA,的过程,转录所需的酶叫,RNA,聚合酶,（依赖,DNA,的,RNA,聚合酶）,转录和复制的相同点,都以,DNA,为模板,原料为核苷酸,合成方向均为,53,方向,都需要依赖,DNA,的聚合酶,遵守碱基互补配对规律,产物为多聚核苷酸链,转录和复制的不同点,复制,转录,模板,两股链均作为模板,模板链作为模板,原料,dNTP,NTP,聚合酶,DNA,聚合酶,RNA,聚合酶,产物,子代,DNA,双链,mRNA,、,tRNA,、,rRNA,、,sRNA,、,lncRNA,配对,A-T,、,G-C,A-U,、,T-A,、,G-C,引物,需,RNA,引物,-,方式（特点）,半保留复制,不对称转录,第一节 模板和酶,一、转录模板,两股,DNA,单链中只有一股可转录，可作为模板转录成,RNA,的一股称为,模板链,，对应的一股互补链称为,编码链,。,能转录出,mRNA,然后指导蛋白质合成的部分称为,结构基因,。其余的,DNA,可能转录（,rRNA,，,tRNA,），也可能不转录。,不对称转录,:,DNA,分子上一股可转录，另一股不转录；模板链并非永远在同一单链上。,二、,RNA,聚合酶,反应特点,以四种核苷三磷酸（,NTP,）为底物，以,DNA,为模板；,以,53,方向合成；,无需引物，直接在模板上合成,RNA,链；,碱基配对是：,A-U,和,G-C,；,DNA,的两条链中仅一条链可作模板，该链称模板链（负链），另一条链称编码链（正链）。,1,、原核生物的,RNA,聚合酶,大肠杆菌,RNA,聚合酶,分子量为,480 kD,，由四个亚基组成,2,（,全酶,）,去掉,亚基称为,核心酶,大肠杆菌,RNA,聚合酶各亚基及其功能,亚基,基因,分子量,亚基数目,功能,rpo,A,40,000,2,酶的装配，与启动子上游元件和活化因子结合,rpo,B,155,000,1,结合核苷酸，催化磷酸二酯键形成,rpo,C,160,000,1,结合,DNA,模板,rpo,D,32,000-92,000,1,识别启动子，促进转录起始,9,000,1,未知,2,、真核生物的,RNA,聚合酶,功能,对鹅膏覃碱,的,敏感,性,RNA,聚合酶,I,转录,45S,rRNA,（,5.8S,rRNA,、,18S,rRNA,、,28S,rRNA,的前体）,不敏感,RNA,聚合酶,II,转录,hnRNA,（,mRNA,的前体）,敏感,RNA,聚合酶,III,转录,tRNA,、,5S,rRNA,、,U6,snRNA,、,scRNA,中等敏感,三、酶与模板的辨认结合,原核生物的,RNA,聚合酶是结合到,DNA,的启动区开始转录的，靠其,亚基辨认启动区。启动区具有共有的序列称为,保守序列,或一致性序列。,TTGACA TATAATPu,-35,区的序列与起始点的辨认有关，称为辨认位点,-10,区的序列称为,Pribnow,盒（,box,）结合位点,第二节 转录装置,一、转录起点,DNA,序列按编码链（与,RNA,链一样）书写，由左至右为,53,方向。与,mRNA,序列相同的为,正链,（编码链），互补的链为,负链,（模板链）。,转录起点：即每个转录单位的起点。该点的核苷酸标号为,+1,。右侧为下游，用正的数码表示；左侧为上游，用负的数码表示。,二、启动子,即转录起始的信号序列。,1,、大肠杆菌基因组的启动子,Pribnow,框（,-10,序列）,：起点上游约,-10,处，保守序列,TATAAT,，,-10,序列有助于,DNA,局部双链解开（,A-T,配对易解开）,识别区（,-35,序列）,：中心位置约在,-35,处，保守序列,TTGACA,；,-35,序列提供了,RNA,聚合酶识别的信号。,2,、真核生物基因组的启动子,Hogness,框（,TATA,框）,：中心在,-25 -30,处，保守序列,TAAA(T)AA(T),，有助于,DNA,局部解开。,CAAT,框,：,-75,处，保守序列,GGT(C)CAATCT,，与,RNA,聚合酶结合有关,GC,框,：在更上游处，保守序列,GGGCGG,，与某些转录因子结合有关。,RNA,聚合酶,III,（转录,5S RNA,等）的启动子在转录区内部。,三、终止因子,rho,因子,：具有核酸酶活力（水解三磷酸核苷），在,RNA,聚合酶遇到终止子暂停作用时，解,RNA-DNA,螺旋。,终止因子（,NusA,）,：协助,RNA,聚合酶识别终止信号的辅助因子，与,RNA,聚合酶的核心酶结合（,2,-NusA,复合物），,识别终止序列,。,四、终止子,提供转录停止信号的,DNA,序列,终止子可被,RNA,聚合酶或其辅助因子识别，但终止信号应位于已转录的序列中。,原核生物的终止子在终止点之前，有一个回文结构，其转录产生的,RNA,可形成一个,发夹结构,，使聚合酶停止移动。,大肠杆菌的两类终止子,不依赖于,rho,（,）的终止子,（简单终止子）：除能形成,发夹结构,外，在终点前还有,寡聚,U,（约,6,个）序列，这个寡聚,U,序列可能提供信号使,RNA,聚合酶脱离模板。因为由,rU-dA,组成的,RNA-DNA,杂交分子具有特别弱的碱基配对作用。,依赖于,rho,（,）的终止子,：能形成发夹结构，无寡聚,U,序列。必须在,rho,因子存在时才发生终止作用。,第三节 转录过程,一、转录的起始,1,、原核生物的转录起始,RNA,聚合酶结合到,DNA,链上，,DNA,双链部分解开形成转录空泡。原核生物由,因子辨认转录起始位点，原核生物在,-35,区有,5,-,TTGACA,，,在,-10,区有,TATAAT,盒,转录起始不需引物,5,-,PPP,G,P,N-OH,第一个磷酸二酯键形成后，,亚单位即脱落下来,RNA,聚合酶与,DNA,模板链的结合,转录起始,模板链,合成方向,2,、真核生物的转录起始,顺式作用元件（,cis,-acting element,）,-35,区,Hogness,盒,（,TATA,盒）,-40,-110,区,CAAT,盒,GC,盒,反式作用因子（,trans,-acting factor,）,转录因子（,TF,）,3,、转录因子和真核生物的转录起始复合物,TF IIA,、,B,、,D,、,E,、,F,起始前复合物（,PIC,）,二、转录的延伸,原核生物和真核生物基本相同,亚基脱落，核心酶构象改变，,NusA,结合,RNA,的,5,端伸展在转录空泡之外,模板为,A,，转录产物相应为,U,原核生物的转录和翻译同时进行,RNA,链的延长,三、转录的终止,1,、原核生物转录终止的模式：,依赖,因子,：,因子能与,RNA,结合，还具有,ATP,酶和解链酶的活性）,不依赖,因子：,终止区的碱基可形成特殊的结构，,RNA 3,形成茎环结构和一串寡聚,U,a,）依赖,-,因子的终止子的终止反应,-,因子,含六聚体的寡聚蛋白，具有依赖,RNA,的,NTP,酶活性。,结合于新生,RNA,上，借助与水解,NTP,产生能量推动,RNA,聚合酶向前移动。,当酶遭遇终止子时暂停前进，,-,因子追上酶，与酶相互作用释放,RNA,。,还具有,RNA-DNA,解螺旋酶活性。,b,）不依赖,-,因子的终止子：含富,GC,的回文序列和寡聚,U,序列,转录终止,RNA,释放,聚合酶脱离,2,、真核生物的转录终止,编码链上存在转录终止的修饰点,AATAAA,真核生物,mRNA,带有,polyA,尾巴,转录的过程,核心酶,因子,5,pppG,mRNA,5,3,3,5,启动子,结构基因,终止区,识别,起始,延伸,因子,5,pppG,终止,5,pppG,2-9 nt RNA,2017,年：一个特殊的,DNA,聚合酶,来自于一种深海噬菌体,NrS-1,一级结构同源于引物酶,-,聚合酶,无需引物,从一个特定的,DNA,序列起始,DNA,的复制,It represents a unique de novo,replicative,DNA polymerase that possesses features found in,DNA polymerases,primases,and RNA polymerases.,PNAS,2017,doi,:10.1073/pnas.1700280114,第四节 转录后的修饰,一、原核生物,RNA,的加工,二、真核生物,RNA,的一般加工,三、,RNA,的拼接,一、原核生物,RNA,的加工,1,、原核生物,rRNA,前体的加工,结构,：每个转录单位由,16S,、,23S,、,5S,rRNA,以及一个或几个,tRNA,基因所组成。,RNAase,：裂解产生,16S,和,23S,rRNA,的前体；,RNAaseE,：裂解产生,5S,rRNA,前体（,P5,）；,RNAaseM16/M23,：分别切除,P16,和,P23,两端的互补序列；,RNAaseM5,：切除,P5,的两端附加序列。,RNAase,RNAaseP,RNAaseM16,RNAaseM23,RNAaseM5,2,、原核生物,tRNA,前体的加工,结构,：,tRNA,基因大多成簇存在，或与,rRNA,、,mRNA,基因组成混合转录单位。,1,）,由核酸内切酶在,tRNA,两端切断,：,5-,核酸内切酶,（,RNAaseP,）：在,tRNA5,端切开，是,tRNA,的,5,成熟酶,3-,核酸内切酶,（,RNAaseF,）：在,tRNA,近,3,端处切开,2,）,核酸外切酶,（,RNAaseD,）：,从前体,3,端逐个切去附加的序列，直至,tRNA,的,3,端，是,tRNA,的,3,成熟酶。,3,）,在,3,端加上,-CCA,OH,-CCA,OH,结构对接受氨酰基的活性是必要的。,一类是本身具有,CCA,；另一类没有，需要,tRNA,核苷酰转移酶,催化逐个加上,CCA,。,4,）,核苷的修饰,：,由特定的,tRNA,修饰酶催化，如假尿嘧啶核苷的糖苷键发生移位反应（由尿嘧啶的,N1,变为,C5,）。,3,、原核生物,mRNA,前体的加工,一般不加工；少数多顺反子,mRNA,通过核酸内切酶切成较小的单位，再行翻译。,二、真核生物,RNA,的一般加工,1,、真核生物,rRNA,前体的加工,结构：,由,1618S,、,2628S,和,5.8S rRNA,基因组成一个转录单位。,5S rRNA,成簇存在。,加工：,由,RNAase,以及其他,核酸内切酶,进行加工。,2,、真核生物,tRNA,前体的加工,结构：,tRNA,基因成簇排列。,加工,核酸内切酶和外切酶,：切去,tRNA,前体,5,端和,3,端的附加序列。,核苷酰转移酶,：在,tRNA3,端逐个加上,CCA,序列。,修饰酶,：,tRNA,特异成份的修饰。,3,、真核生物,mRNA,前体的一般加工,5-,端帽结构的形成,(m,7,GpppG),O,型帽子：,m,7,G,5,ppp-,I,型帽子：,m,7,G,5,ppp,5,N,1,mpN,2,p-,II,型帽子：,m,7,G,5,ppp,5,N,1,mpN,2,mp-,3-,端,poly A,尾巴的生成,由多聚腺苷酸聚合酶催化，以带,3-OH,基的,RNA,为受体，,ATP,为供体，在,3,端逐个加上,A,。,功能：保护,mRNA,。,mRNA,内部的甲基化,真核生物,mRNA,的,5-,端帽结构的形成,真核生物,mRNA,的,5-,端帽结构的形成,功能：,翻译过程中起识别和稳定作用。,RNA,三磷酸酶,pppN,1,pN,2,p-RNA,ppN,1,pN,2,p-RNA,+,Pi,mRNA,鸟苷酰转移酶,ppN,1,pN,2,p-RNA,+,GTP,G,5,ppp,5,N,1,pN,2,p-RNA,+,PPi,mRNA,（鸟嘌呤,-7,）甲基转移酶,G,5,ppp,5,N,1,pN,2,p-RNA,+,SAM,m,7,G,5,ppp,5,N,1,pN,2,p-RNA,+,SAH,mRNA,（鸟嘌呤,-2,）甲基转移酶,m,7,G,5,ppp,5,N,1,pN,2,p-RNA,+,SAM,m,7,G,5,ppp,5,N,1,m,pN,2,p-RNA,+,SAH,三、,RNA,的拼接,断裂基因（,split gene,）,外显子（,exon,）,内含子（,intron,）,从中断基因线性表达 的方式分,翻译前删除内含子,翻译绕过内含子,翻译后删除内含子,内含子定义扩充,内含子是隔断基因线性表达的序列,RNA,拼接的类型,类型,I,自我拼接：真核生物细胞器（线粒体、叶绿体）基因、低等真核生物核,rRNA,基因、细菌和噬菌体的个别基因，需要游离,鸟苷酸,发动转酯反应。,类型,II,自我拼接：真菌线粒体、植物叶绿体基因，,套索状剪接,。,核,mRNA,的拼接：,套索状剪接，,GU-AG,规则,，需要核微小核糖核蛋白参与。,核,tRNA,的酶促拼接：,酶促拼接,。,1,、类型,I,自我拼接,结构,：,rRNA,前体为,35S,，其中,26S,rRNA,基因中有一内含子。,拼接,第一步：鸟苷酸（,G,）的,3-OH,攻击内含子的,5,端磷酸基,，使内含子的,5,末端磷酸基转移到,G,的,3-OH,上，也就使内含子,5,末端断开；,第二步：,第一个外显子产生的,3-,羟基,攻击第二个外显子,5,端磷酸基,，使第二外显子的,5,末端磷酸基转移到第一外显子,3-OH,上。这样使内含子切下，外显子连接；,第三步：,切下的内含子,3-OH,攻击自身,5,端附近,（第,15,个核苷酸处）的,磷酸基,，形成一个环状分子。,类型,I,自我拼接：无需酶的参与，需要游离鸟苷酸发动转酯反应，自我催化拼接。,核酶（,ribozyme,）,核酶（,ribozyme,）：具有催化活性的,RNA,1982,，,T.R.,Cech,，四膜虫,rRNA,前体,1983,，,S.Altman,，,RNase,P,对,tRNA,前体加工,锤头状核酶，发夹状核酶,人工核酶（抗感染，抗肿瘤）,2,、核,mRNA,的拼接：套索剪切模式,结构,：,内含子左端（供体）均为,GU,，右端（受体）均为,AG,，这称,GU-AG,规律。,拼接,：,第一步，内含子左端切开：内含子,3,端上游,30,核苷酸附近的,CUGAC,序列中的,A,的,2,-OH,进攻内含子,5,端磷酸二酯键，,与其形成,5,2-,磷酸二酯键，即套索结构；,2-,第二步，内含子的右端切开；左侧外显子,3-OH,攻击右侧外显子的,5-,磷酸二酯键,，两个外显子连接在一起；,第三步，套索状内含子去分支而成线状分子。,2-,核微小核糖核蛋白（,snRNP,）的参与,hnRNA,内含子有,5 GUAG 3,5GU,：,U,1,-snRNA,结合（,snRNP,）,分支点,A,：,U,2,-snRNA,结合（,snRNP,）,hnRNA,：,mRNA,的前体,U,1,，,U,2,：,核内,U,族蛋白质,snRNA,：,300,个核苷酸组成，与核内,U,族蛋白质组成,snRNP,（核微小核糖核蛋白）,mRNA,的成熟与转运,3,、类型,II,自我拼接,与核,mRNA,的拼接类似，套索剪切模式；,无,GU-AG,规则；,无核微小核糖核蛋白参与。,4,、,核,tRNA,的酶促拼接,结构,：内含子插在靠近反密码子处，部分与反密码子碱基配对，这样反密码子环不存在，只有内含子构成的环。,第一步，特异的内切酶切下内含子,左侧,tRNA,半分子成,2,3-,环状磷酸基,；,右侧,tRNA,半分子成,5-,羟基；,内含子,5,端为羟基，,3,端为,2,3-,环状磷酸基,；,第二步,左侧,tRNA,半分子,2,3-,环状磷酸基被打开形成,2-,磷酸基,和,3-,羟基,（,环磷酸二酯酶,催化）,右侧,tRNA,半分子,5-,羟基转变成,5-,磷酸基,（,激酶,催化）,AMP,连接到,5-,磷酸基,上（,连接酶,催化）,第三步,左侧,tRNA,半分子的,3-,羟基,攻击右侧,tRNA,半分子的,高能磷酸酐键,AMP,被取代而产生,5,3-,磷酸二酯键,。,切除,2-,磷酸基。,本章重点,掌握模板链、编码链、不对称转录的概念。,掌握断裂基因、外显子，内含子概念。,熟悉真核生物，,mRNA,、,tRNA,及,rRNA,转录后加工的主要方式。,转录终止的方式。,结束,