循环肿瘤细胞(CTC)检测在肺癌中应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,循环肿瘤细胞（,CTC,）检测在肺癌中的应用,肿瘤疾病近期疗效的判断方法,影像学方法,血清肿瘤相关标记物测定,病理学方法,CTC,临床因子作为预后与预测因子,预后：,T,N,M staging,PS score,预测：,吸烟状况：指导靶向治疗,性别：指导靶向治疗,种族：指导靶向治疗,组织学：指导化疗和靶向治疗,影像学方法,非侵入地、直观地对患者的肿瘤大小变化情况进行评估。,缺点：,存在一定的健康危害或健康隐患,肿瘤大小常与肿瘤的恶性程度或浸润能力不完全一致,费用昂贵,滞后性,灵敏性低,病理学方法,手术或活检获得病灶组织,/,周围淋巴结组织，进行病理学染色和分析，是目前唯一明确肿瘤有否转移的金标准,缺点：,精确度不够高,是侵入性检查手段,易造成扩散,人工误差大,难以标准化,血清肿瘤标记物测定,血清肿瘤标志物的浓度往往可以在一定程度上提示肿瘤的发展程度,缺点：,特异性不高,易受非特异蛋白的干扰,其他的病理生理状态影响导致假阳,/,阴性结果,1869,年,Aust Med J,，,Ashworth,最早在转移性癌症患者血液中观察到。,2005,年,N Engl J Med,，,Cristofanilli,证实治疗前,CTC,数目是转移性乳腺癌患者无进展生存期和总生存期的独立预测因子。,循环肿瘤细胞指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。,循环肿瘤细胞,原发肿瘤血管生成侵润,侵入血管内,侵入血管外,(CTC),血管内增殖,(CTM),转移,转移,播散肿瘤细胞（,DTC,）微转移休眠灶,循环肿瘤细胞（,CTC,）,循环肿瘤,微栓,（,CTM,）,凋亡的,CTC,侵润,肿瘤细胞,扩增,血管生成,上皮间质转化,（,EMT,）,间质上皮转化,（,MET,）,转移到骨髓和其他器官,CTC,检测,预测,PFS,及,OS,指示预后效果,复发转移预测与分期,有助于肿瘤个体化治疗的药物筛选和治疗方案的确定,是传统的影像学及其他生物标志物的补充检测手段,有助于寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物,实时,方便,及时,准确,微创,肿瘤细胞作为生物标志物,外周血和肺静脉血中的循环肿瘤细胞（,CTCs,）,临床意义,:,转移的辅助标志物？,可以预测治疗？,预后因子？,最小损伤的突变检测,?,获取,CTC,需要解决的技术问题,从红细胞和白细胞中,富集,恶性肿瘤细胞,将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常上皮细胞、造血干细胞等,区分,开来,每,10mL,血液中可能仅含有几个到几十个循环肿瘤细胞，而,10mL,血液中含有的白细胞约有,1,亿个，红细胞有,500,亿个。,三种技术,过滤法,ISET:Isolation by Size of Epithelial Tumor cells,8m,孔径过滤膜，漏检体积较小的肿瘤细胞,敏感性低,梯度密度法,肿瘤细胞和单核细胞密度小于,1.077g/ml,CTC,纯度低，混入较多白细胞,肿瘤细胞会迁移至血浆层，而聚集后容易下沉,聚蔗糖,-,泛影葡胺,(,Ficoll-Hypaque,),对细胞有毒性,免疫磁珠法,肿瘤细胞表面抗原,CTC,纯度低，混入较多白细胞,不能有效排除细胞碎片,假阳性和假阴性高,Cell Search-,免疫磁珠,+,流式细胞分析,+,化学发光,90,年代中期开始摸索捕获、分析,CTC,的方法,1999-2003,大量临床实验建立,CellSearch,与,CTC,的临床相关数据,2004,获得美国,FDA,批准用于临床,2009,Cleveland Clinic,十大医学突破第一名,2009 Prix Galien USA,最佳医学技术奖,2010.1,中国,CTC,在复发转移乳腺癌上的应用注册实验,2011,.5,CTC,在小细胞肺癌上的应用实验研究,CellSearch,是全球第一也是唯一经,FDA,批准可用于临床的循环肿瘤细胞（,CTC）,产品,1983,磁流体,J,Clin,Oncol,.2011 Apr 20;29(12):1556-63.,Epub,2011 Mar 21.,Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer.,1,肺癌是最常见的原发性恶性肿瘤，,85%,的肺癌患者为非小细胞肺癌，大多数患者发现时已是晚期，其,5,年生存率只有,2%,。,2,目前，仍然缺乏有效的生物标记物预测治疗的有效性。,CTC,是一个潜在的疗效预测因子。,3,验证能否在,NSCLC,患者中检测出,CTC,及,CTC,能否预测治疗有效性。,背景,实验流程,病人,入组,基线,CTC,检测,化疗一,个疗程,CTC,检测,统计,分析,患者入组标准,未做过化疗，且,4,周内未做过放疗,病理学确诊为非小细胞肺癌,IIIA,IIIB,IV,期,准备进行标准的细胞毒疗法,5,年内未患过恶性肿瘤,实验方法,CellSave,专用收集管采集血液,采集血后于室温储存并于,96,小时内进行检测,Cellsearch,系统进行检测,患者化疗前,CTC,数量（基线,CTC,）与临床特征的关系,IV,期患者,CTC,数量明显多于,IIIB,期患者，,IIIB,期患者的,CTC,数量又明显多于,IIIA,期患者,。,肝转移及骨转移患者中,CTC,数量明显多于其它转移患者。,患者化疗前,CTC,数量与肿瘤转移地点的关系,所有非小细胞肺癌病人,所有,期非小细胞肺癌病人,基线,CTC,数量与无进展生存期和总生存期的关系,基线,CTC,数量少于,5,的患者无进展生存期和总生存期明显高于基线,CTC,数量大于等于,5,的患者。,化疗前后,CTC,数量与患者无进展生存期和总生存期的关系,化疗后,CTC,数量少于,5,的患者无进展生存期和总生存期明显高于,CTC,数量大于,5,的患者。,化疗前后,CTC,数量都少于,5,的患者无进展生存期和总生存期明显高于只有一次测出,CTC,数量少于,5,的患者。,化疗前后,CTC,的数量变化反映临床疗效,化疗前,化疗后,化疗后,CTC,数量减少患者的临床疗效好于,CTC,数量增加的患者,结 论,CTC,能在,IV,期非小细胞肺癌患者中检出,CTC,数量的变化反映了临床疗效,CTC,数量与,OS,和,PFS,相关，是非小细胞肺癌的一个,新的预后判断因子,CTC,在判断是否存在转移中有重要参考价值,对于原发性肺癌患者，,CTC,计数在有远处转移的肺癌患者中有显著升高，相关性优于,CEA,。,CTC,升高对于判断远处转移的敏感性达,71%,，特异性达,83%,CTC,计数和血清,CEA,水平在不同切点的诊断价值,治疗前和治疗后,CTC,的数量变化反映疗效,大多数患者的,CTC,数量在第一个化疗疗程后（,22,天）下降，提示疗效好。,The Annals of Thoracic Surgery Volume 87,Issue 6,June 2009,Pages 1669-1675 Circulating Tumor Cells in Pulmonary Venous Blood of Primary Lung Cancer Patients,鳞癌中,periCTC,和,pvCTC,的数量明显高于腺癌,N,Engl,J Med 2008;359:366-77.Detection of Mutations in EGFR in Circulating Lung-Cancer Cells,1,吉非替尼是较好地治疗非小细胞肺癌的靶向药物，但是,EGFR,的基因型决定了药物的治疗效果。,2,目前，检测,EGFR,的基因型需要选取患者的肿瘤组织，找到一种非侵入性的方法检测,EGFR,迫在眉睫。,3,验证能否在,CTC,中检测,EGFR,的基因型，且与药物疗效相关。,背景,CTC,中,EGFR,突变与肿瘤组织中,EGFR,突变的一致性（,SARMS,方法）,CTC,中,EGFR,基因型有,17,个与肿瘤组织中的一样，准确率为,94%,，,CTC,数量与病情进展的关系,吉非替尼治疗后,CTC,数量下降，伴随着疾病进展,CTC,数量也随之上升。,肿瘤大的患者,CTC,数量比肿瘤小的患者多。,CTC,数量,影像学肿瘤变化,检测,CTC,中,EGFR,的基因型与组织中检测结果高度,符合,可以通过,CTC,来检测非小细胞肺癌患者肿瘤的基因型,CTC,数量与疾病进展密切相关,结 论,小细胞肺癌患者活检组织及相对应的,CTC,中的,CD56,活检组织中的,CD56,和,CTC,中的,CD56,表达具有一致性,肺癌组织,肺癌肝转移组织,Baseline blood CAC,肿瘤细胞,a,monosomy 6p11-q12;,b,amplification EGFR,c-MYC;EGFR(red)5.p15.3(green),6p11-q12(aqua),c-MYC(yellow).,c,trisomy CEP3 and monosomy CEP17;,d,polysomy CEP3,CEP7,CEP17 and 9p21.3.CEP3(red),CEP7(green),CEP17(aqua),9p21.3(yellow).,外周循环肿瘤细胞的异常情况与手术切除的肿瘤细胞具有高度一致性。,Baseline blood CTC,肿瘤细胞,CTC,中的染色体异常分子标记物与疾病的复发和生存密切相关,CTC,计数,CTC,的分子特性,指示预后,辅助检测抗癌药物的反应,作为预测和,/,或药物动力学生物标志物,联合已知的分期因素，获取更精确的预后,判断病人是否需要辅助化疗,检测癌症复发,辅助诊断,实时活检,肿瘤的生物学行为,阐明预后和预计的分子学特征,检测抗药情况,基于获得连续样本的便利性,提高对生物过程机制的了解,发现并鉴定新治疗靶点,CTC,的应用：从细胞计数到分子特性,FISH,分析,CTC,生物学特性,白细胞有两份,CEP7,（绿色），,EGFR,（红色）和,MET(,蓝色,),CTC,中，,EGFR,（红色）和,MET(,蓝色,),基因扩增,微列阵,实时定量,RT-PCR,对,CTC,进行基因表达分析,BIOTECAN,宝藤,J&J,强生,国内首个,CELLSEARCH,商业实验室,CH,商业实验室,CTC,检测样本准备：,使用,CellSave,储存管采集静脉血液标本,10ml,轻轻颠倒,8,次，防止凝块,样本室温条件,(15-30,摄氏度,),下,96,小时之内接受处理,接受阿霉素治疗的患者给药之后，至少需要等待,7,天,样本溶血及结块不能用于,CTC,检测！,NOTICE,样本处理流程：,7.5ml,血液采集于,CellSave,储存管，加入,6.5ml,缓冲液,离心,CellTracksAutoPrep,系统自动处理流程,系统自动将被捕获的、经过染色的细胞置入,MagNest,装置的样本盒中,系统自动分析后得到结果并由操作人员进行最终判读,分析结果并出具报告单,若患者血液样本中,CTC,细胞,cut off,值，我们将附上,CTC,细胞图；,若患者血液样本中,CTC,细胞,cut off,值，我们只截取其中五个,CTC,细胞图作为代表。,每周二、周五开始检测，报告将于检测后,3,个工作日内发送。,请注意采血时注意样本保质期（,96h,），选择合适的采血时间。,