尖锐湿疣基因诊断方法.doc

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尖锐湿疣基因诊断方法（专业文档）
（一）标本的采集及处理
标本的采集和预处理：用刮板或生理盐水浸润的棉棒从阴道和宫颈外口取分泌物和细胞。标本核酸的提取，按1体积细胞悬液加10倍体积的细胞裂解液37℃下处理过夜；
（二）PCR扩增
1、引物设计和合成：HPV基因组可分为早期区（E）和晚期区（L），每区含一系列开放读码框架（ORF）。
2、PCR反应试剂：TaqDNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/LdNTP贮备液，10×PCR缓冲液，100μmol/LMY11和MY09贮备液，灭菌的玻璃蒸馏器制备的蒸馏水。
3、PCR扩增方法和程序：以100μlPCR反应液，用无菌0.5ml硅化塑料离心管为反应管进行扩增反应。
（三）扩增产物的检测和分析
1、凝胶电泳：扩增反应结束后，取出反应管，冷却至室温，取10μl扩增产物用5%-7%聚丙烯酰胺凝胶或1.5%琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪下分析结果，分子量约为450bp处出现明显的DNA带。
2、核酸杂交：如果凝胶电泳无清楚的DNA或需确定DNA带的特异性时，可用标记的公用混合探针和（或）型特异探针作Southern吸印杂交、斑点杂交验证。
用PCR方法检测HPV比核酸杂交方法优越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝胶电泳直接分析结果，可检出标本中200个拷贝的HPVDNA，若以核酸杂交检测PCR产物，敏感性提高，能检出10个拷贝的HPVDNA。
鉴于PCR技术的高度敏感性，以生殖道脱落细胞为检材足以满足试验要求，避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。一般情况下，PCR扩增产物经凝胶电泳，观察产生的DNA可直接作出诊断。因此，PCR技术检测HPV实验周期短、简便快速。
每个人都希望自己能拥有健康，因为健康是生活幸福，事业成功的基础。回溯上个世纪中期，人们普遍概念认为“没有疾病就是健康”；至1977年，世界卫生组织将健康概念确定为“不仅仅是没有疾病和身体虚弱，而是身体、心理和社会适应的完满状态”；到20世纪90年代，健康的含义注入了环境的因素，即健康为：“生理—心理—社会—环境”四者的和谐统一；进入21世纪，“健，康、智、乐、美、德”六个字组成了更全面的“大健康”概念，成为幸福人生的更佳境界。同时，大家保持好心情锻炼好身体，一定会健健康康！以上内容仅供参考，如有必要请去医院咨询。