资源描述
<p>人肺癌细胞系中LASS2/TMSG-1 mRNA和蛋白的表达及其意义
徐海芹1李时荣 2 翁立新 2 王静媛2 海岭 2 徐晓艳3* （1内蒙古医科大学基础医学院 内蒙古 呼和浩特 010059.2内蒙古医科大学基础医学院病理学教研室，内蒙古 呼和浩特 010059.3内蒙古医科大学附属医院病理科，内蒙古 呼和浩特 010059。*通讯作者，E-mail: xxy_patho@）
基金项目：国家自然科学基金（81201854），内蒙古自然科学基金（2014MS0858）
摘要:目的 探讨 LASS2/TMSG-1 mRNA和蛋白在不同转移潜能人肺癌细胞系中的表达及其意义。方法 采用 MTT 增殖实验、Transwell 侵袭实验、划痕修复实验检测人肺巨细胞癌低转移亚系 95C 和高转移亚系 95D 两株细胞的增殖、侵袭及迁移能力；RT-PCR反应检测 LASS2/TMSG-1的mRNA在两株细胞中的表达水平，Western blot 方法检测 LASS2/TMSG-1的蛋白在两株细胞中的表达水平。结果 MTT 增殖实验显示，第二天~第五天95C、95D两细胞增殖差异均具有显著性（P均＜0.05），95D细胞的增殖能力强于95C；Transwell 侵袭实验结果表明 95D细胞的侵袭能力显著高于 95C 细胞（t=﹣20.62，P＜0.05）；划痕修复实验证实了95D 细胞的迁移能力强于 95C 细胞（t=23.56，P＜0.05）；由此证明 95D 细胞为高转移亚系，95C 细胞为低转移亚系。LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在 95C 细胞（低转移亚系）中的表达明显高于95D 细胞（高转移亚系）中的表达，差异具有显著性（P 均＜0.05）。结论 LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白在人肺癌低转移亚系中的表达显著高于在高转移亚系中的表达，证实了两者可能参与抑制人肺癌的增殖、侵袭及迁移过程。
关键词: 肺癌；LASS2/TMSG-1的mRNA；蛋白
The expression and significance of LASS2/TMSG-1’s mRNA and protein in human lung cancer cell lines
XU Hai-qin1 ,XU Xiao-yan 2,3,PEI Lu-tian2,3,LI Shi-rong2,3, WENG Li-xin2,3, LI Xiu-xia2,3
Department of preclinical medicine Inner Mongolia Medical University, Hohhot, 010059 ,China
Department of Pathology, Inner Mongolia Medical University, Hohhot, 010059 , China
Department of Pathology,Inner Mongolia Medical University Affiliated Hospital, Hohhot,010059,China
Abstract: Purpose To investigate the expression and significance of LASS2 / T M S G-1 mRNA and protein in human lung cancer cell lines with different metastatic potentiality. Methods The proliferation , invasion and migration ability of cells were tested by MTT、 Transwell assay and wound healing assay; the expression level of LASS2/TMSG-1 protein in human lung cancer cell lines were detected by western blot and the expression level of LASS2/TMSG-1 mRNA in human lung cancer cell lines were detected by RT-PCR. Results MTT proliferation test verified that 95D cell was stronger than 95C(P＜0.05); Transwell invasion assay showed that the invasion ability of 95D was significantly higher than 95C(t=﹣20.62， P=0.00); wound healing assay confirmed that the migration ability of 95D was higher than 95C (t = 23.56，P=0.00). The expression of LASS2/TMSG-1’s mRNA and protein in 95C with low metastatic potentiality were significantly higher than the expression in 95D cell with high metastatic potentiality, the difference was significant(P <0.05 ) Conclusion The expression levels of LASS2/TMSG-1 mRNA and protein in lung cancer cell lines with low metastatic potentiality were significantly higher than that in lung cancer cell lines with high metastatic potentiality, which confirm that the two targets are involved in the proliferation、invasion and migration of human lung cancer cells.
Key words: lung cancer; LASS2/TMSG-1’s mRNA ;LASS2/TMSG-1’s protein
近年来肺癌成为人类死亡的重要肿瘤之一，全球每年约 1 亿人死于肺癌[1]。目前研究表明，肺癌患者肿瘤的侵袭和转移是其恶性程度的主要标志，也是造成其生存率低、死亡率高的主要原因。因此，探讨造成肺癌侵袭、转移的重要机制，寻找与肺癌侵袭转移相关基因至关重要。TMSG-1 蛋白是一个跨膜蛋白，有六个跨膜区，定位于内质网线粒体等细胞质膜系统。TMSG-1 基因位于染色体1q21.2, cDNA全长为2 kb. TMSG-1编码的蛋白质含380个氨基酸, 分子质量为4500, 包含有HOX、 TLC两个功能域,属于LASS家族。LASS2(homo sapiens longevity assurance hom-0109ue 2)是2001年上海复旦大学遗传学研究所从人肝cDNA文库中克隆出的与酵母长寿保障基因LAG1 高度同源的新基因, 与TMSG-1 高度同源[2].研究表明TMSG-1可以促进神经酰胺合成， 并且与肿瘤转移有密切的关系，包括抑制细胞生长，促进调亡，从而抑制肿瘤的侵袭和转移等。 另外，其与质子泵V-ATPase的相互作用，可调节细胞内外的H+的量，从而抑制基质金属蛋白酶的分泌和激活。TMSG-1发挥的抑制肿瘤作用目前认为可能：①与液泡型ATP 酶的功能有关；②与神经酰胺的合成有关；③促进细胞凋亡有关等[3,4,5]前期研究已发现TMSG-1 能够抑制前列腺癌，肝细胞癌，肺癌、膀胱癌以及乳腺癌等多种肿瘤细胞的侵袭及转移能力，从而被认为是一种候选的肿瘤转移抑制基因。
本文通过检测不同侵袭、转移潜能的人肺癌细胞中LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白的表达，进一步证实了两者是否参与抑制人肺癌的生长、侵袭及迁移过程，为两者与人肺癌侵袭、转移的关系及其相关性的研究奠定基础。
1.材料与方法
1.1. 一般资料：人肺巨细胞癌低转移亚系 95C、人肺巨细胞癌高转移亚系 95D 均购于上海复祥生物科技有限公司。胎牛血清和 RPMI 1640 培养液购自 Gibco 公司；6 孔细胞培养板和 Transwell 小室（内径 6.5 mm，孔径 8.0 μm）购自 Corning公司；MatrigelTM 购自 BD 公司； 羊抗人多克隆抗体LASS2/TMSG-1购自北京博奥森有限公司； LASS2/TMSG-1工作浓度1：400；羊抗人单克隆抗体β-actin购自北京博奥森有限公司，工作浓度1:1000；Trizol购自invitrogen公司；RT试剂盒均购自Transgene基因有限公司。
1.2. 细胞系及细胞培养：人肺巨细胞癌高转移亚系 95D 细胞于上海复祥生物科技 有限公司购买，此株细胞最早为北京 301 医院建株[10]。均用含 10%（体积分数） 小牛血清的 RPMI 1640 培养液，于 37℃、5%（体积分数）CO2 孵育箱中培养。
1.3.MTT 法检测细胞增殖能力： 收集对数期生长细胞，1ml 0.25%胰酶消化，1ml完全培养基终止消化，1000rpm，离心 5min；离心后弃上清并加 1ml 培养基制成单细胞悬液；取 10µl 胎盼蓝及 10µl 细胞悬液计数，计数后用培养基调整细胞浓度为 1×103/100µl（3为上标）；7 个 96 孔板中每孔接种 1×103 个细胞，培养基补足 100µl，每个孔均设六个平行复孔，过夜至细胞单层铺满孔底，接种当天记为零天，温箱孵育，隔天换液；测定前 4h，每孔加入 20µl MTT 溶液，温箱孵育 4h；4h 后超净台弃每孔培养液，加入 150µl DMSO 置摇床低速震荡 10min，使结晶充分溶解；30min 内在酶标仪中检测 490nm 处各孔吸光值，连续检测五天。该实验独立重复三次。
1.4.Transwell 体外侵袭实验：用 50mg/L Matrigel 胶 1：8 稀释包被Transwell 小室的上室，37℃ 烘干 30min 至胶凝固；细胞消化离心后用含 1%FBS 的培养基重悬细胞，调整细胞密度为 1~10×105 个，向 Transwell 上室每孔加入 200µl 细胞，24 孔板的下室加入 500µl10%FBS 的培养基；常规培养细胞 12~24h，依据镜下观察侵袭情况结束培养时间；侵袭结束后用 0.1%结晶紫染色，PBS 清洗两次，每组设 3 个平行样本，每张膜由正中水平线及垂直线分为四个象限，选取象限及膜中心的 5 个高倍视野计数穿膜细胞数。实验独立重复三次。
1.5.划痕修复实验：Marker 笔在 6 孔板背后每隔 0.5~1cm 划线，每孔 5 条线；细胞制成单细胞悬液后接种到六孔板中，每孔约接种 1×106 个，接种后常规培养，掌握为过夜细胞能铺满孔底；第二天，用 0.5~10µl 枪头垂直于孔底背后 Marker做划痕，注意枪头要保持垂直；划痕后用 PBS 清洗三次，加入无血清培养基常规培养；分别在划痕后的 0、6、12、24 小时为细胞拍摄照片，每组设三个平行 样本，目测微尺测量划痕宽度并计算划痕修复率，每个样本观察两个视野（划痕 修复率=（[0 小时划痕宽度-各小时划痕宽度]/0 小时划痕宽度）×100%，实验独立重复三次。
1.6.Wesern blot 检测人肺癌细胞系中的 LASS2/TMSG-1蛋白的表达： 两种不同转移潜能人肺癌细胞的培养， 细胞裂解提取总蛋白， 然后进行SDS-PAGE 电泳，电转移，蛋白免疫印迹反应，最后应用 ChemiDox XRS 图像分 析系统观察并照相，蛋白表达量用 OD 值来表示。
1.7. RT-PCR方法 反应检测95C与95D的LASS2/TMSG-1的mRNA表达水平，GADPH及TMSG-1的引物经Gene Bank检索，利用Primer5.0软件设计，由北京奥科生物公司合成，TMSG-1引物序列为：上游， 5'-TCCTGCCTT CTTTGGCTATTACTT-3' ；下游，5'-TGCGTTCAT CTTCTACCAGCTTTC-3'，扩增片段长度约为134bp。GADPH引物序列为：上游，5'-GAAGGTGAAGGTCGGAgTC-3'；下游， 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3' ，扩增片段长度约234bp。95℃预变性3min； 94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸 5min。PCR产物于凝胶成像系统分析仪下下观察并照相。
1.8.统计学处理： 计量资料以±S表示，应用 SPSS 19.0 统计软件对数据进行t 检验，比较 LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白 在不同转移潜能前列腺癌细胞中的表达情况，P＜0.05 认为结果差别具有统计学意义。
2.实验结果
2.1 RT-PCR反应检测95C与95D的LASS2/TMSG-1的mRNA表达水平
图1显示95C细胞的LASS2/TMSG-1的mRNA表达水平明显强于95D细胞，而95C细胞又为低转移潜能细胞系，推测其低转移潜能受LASS2/TMSG-1影响。
图1：95C与95D细胞中LASS2/TMSG-1的mRNA表达
2.2 Western blot 检测95C与95D的LASS2/TMSG-1的蛋白表达水平
图2结果提示95C中LASS2/TMSG-1的蛋白表达量明显高于95D（P＜0.05），而95C细胞又为低转移潜能细胞系，推测其低转移潜能受LASS2/TMSG-1影响。
图2:95C与95D中LASS2/TMSG-1的蛋白表达
2.3 95C、95D两株细胞的增殖能力
MTT实验中，95C、95D两组细胞均设六个平行样本，取六个平行样本的平均值，以生长天数为横坐标，490nm处吸光度为纵坐标绘制95C、95D的生长曲线，第二天~第五天95C、95D两细胞增殖差异均具有显著性（P均＜0.05），95D细胞的增殖能力强于95C，详见图3。
图3: MTT法检测95C、95D两细胞增殖能力
2.4. 95C、95D两株细胞的侵袭能力
Transwell侵袭实验通过用Matrigel基质胶模拟体内细胞外基质，肿瘤细胞通过分泌LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白而由小室上层穿透ECM到达小室下层，通过计数穿透小室的细胞数目来反映肿瘤细胞的侵袭能力。侵袭实验中，95C、95D两组细胞均设3个平行样本，每个样本观测5个视野（×400），95C、95D发生侵袭的细胞个数分别为9.07±0.96、82.53±3.43，差异具有统计学意义（t=-20.62，P=0.00），95D的侵袭能力高于95C，见图4。
图4 体外侵袭实验检测95C、95D细胞的体外侵袭能力
2.5 95C、95D两株细胞的迁移能力
划痕实验能够观察在一个细胞周期内，无血清培养基培养的细胞由细胞区迁移至无细胞区的能力。在我们的划痕实验中，95C、95D两组细胞均设3个平行样本，每个样本观察2个视野（×400），取其平均值，24h后95C、95D两组细胞划痕修复率分别为55%±3%、92%±1%，差异具有统计学意义（t=23.56，P=0.00），95D细胞的迁移能力高于95C，见图5。
图5 体外侵袭实验检测95C、95D细胞的体外迁移能力
3.讨论
肺癌已成为威胁人类健康的重要疾病，多数肺癌在发病时已是晚期，且其早期出现的侵袭和转移是导致其预后较差的主要原因。因此，研究肺癌发生侵袭、转移的机制，寻找和肺癌侵袭、转移密切相关的有效生物学指标，对于预防肺癌的侵袭、转移，提高肺癌患者存活率、降低死亡率具有重要的意义。
LASS2/TMSG-1 作为参与抑制肿瘤侵袭、转移的分子，其主要功能可能与神经酰胺和质子泵V-ATPase有关。目前有研究[6]显示LASS2/TMSG-1主要是引起长链神经酰胺C22:0和C24:0-CoA特异性神经酰胺的合成, 由此可以得出LASS2 基因能诱导神经酰胺合成酶的活性, 使细胞内神经酰胺含量增加. 神经酰胺是神经鞘脂的主要成员之一, 是细胞信号传导途径中的第二信使,参与细胞的分化、增殖、衰老等过程, 特别是在诱导细胞凋亡过程中起重要作用, 如: Paschall等[7]研究发现在肿瘤细胞中凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAP)蛋白调节细胞凋亡阻力,而神经酰胺能诱导IAP蛋白的降解, 使肿瘤细胞对凋亡诱导敏化, 从而促进细胞凋亡.Rego等[8]研究表明神经酰胺生产醋酸导致细胞死亡, 特别是通过Isc1p和Lag1p从头合成催化复杂的鞘脂类水解产生的醋酸引起细胞凋亡. 也有人认为与细胞内吞、 Erk1/2依赖的信号传导通路、 Cox的表达诱导, 以及p53依赖的细胞凋亡有关[9]. 总之LASS2/TMSG-1可以调节体内神经酰胺的表达, 从而通过神经酰胺的促凋亡作用抑制肿瘤生长。
也有研究者认为TMSG-1可以通过直接绑定到V-ATPase的C亚基上与V-ATPase相互作用[10],而C亚基, 又称ATP6L, 是V-ATPase质子泵的关键跨膜部分, 可以逆浓度梯度将H+泵至细胞囊腔中或细胞外, 已有研究[11]发现ATP6L在高转移的肿瘤中高表达, V-ATPase C亚基的高表达, 会诱导Eiger/JNK依赖的细胞转型, 促进正常组织细胞向早期癌组织的转变[12]. 而用基因敲除或化学抑制剂, 沉默ATP6L后, 可以显著的抑制肿瘤的生长、浸润、转移[13]. 研究[14]发现, LASS2的超表达可通过与ATP6L结合, 抑制V-ATPase活性来增加肝癌细胞的胞内H+, 从而通过线粒体途径诱导细胞凋亡. 综上所述, TMSG-1可以通过与V-ATPase的C亚基相互作用, 从而抑制V-ATPase的活性, 使得细胞内pH降低, 而细胞外pH升高, 导致肿瘤细胞凋亡增加,以及其浸润性和转移性降低。
陆应麟[15]等在上世纪八十年代研究发现，来源于同一母细胞的人肺巨细胞癌 95C、95D 细胞具有不同的侵袭、转移潜能，且有较大差异。本研究通过 MTT增殖实验、划痕实验和侵袭实验，证明了 95C、95D 这两种细胞的增殖能力、侵袭能力和迁移能力的显著差异，也进一步验证了95C 细胞的低侵袭转移性能和95D 细胞的高侵袭转移性能。本研究尝试用95C、95D 细胞检测LASS2/TMSG-1的mRNA和蛋白的表达情况，在RT-PCR反应检测中发现95C细胞的LASS2/TMSG-1的mRNA表达水平明显强于95D细胞，而95C细胞又为低侵袭、转移潜能细胞系，推测其低转移潜能可能受LASS2/TMSG-1影响；Western blot 检测显示95C中LASS2/TMSG-1的蛋白表达量明显高于95D（P＜0.05），结合两种细胞的侵袭、转移潜能确有较大差别，我们推断LASS2/TMSG-1可能参与了抑制肺癌细胞的侵袭、转移，并在抑制肿瘤的侵袭转移中发挥了一定的作用，可能因为其表达的上调导致肺癌侵袭转移能力的降低，但具体的机制有待进一步探讨。
综上所述，LASS2/TMSG-1 在人肺癌低侵袭转移亚系的蛋白及mRNA的表达均高于人肺癌高侵袭转移亚系，说明两者可能均与抑制人肺癌的侵袭、转移密切相关。希望对其分子机制做进一步研究，为肿瘤的预后标记和药物治疗靶点提供新的依据。
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作者简介：徐海芹，女，1980-04 生，大学本科，中级检验师
个人简介
姓名：徐海芹 性别：女
出生年月：1980 年 04 月 28 日 学历：大学本科 职称：中级检验师 目前主
要从事检验工作
工作单位：内蒙古自治区人民医院，邮编：010010
联系电话：18047192603 ，</p>
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