绿色银光蛋白.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,绿色银光蛋白,绿色银光蛋白,第1页,OsamuShimomura,MartinChalfie,RogerY.Tsien,（钱永健）,年,10,月,8,日，美,WoodsHole,海洋生物学试验室下村修、哥伦比亚大学马丁,-,沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校钱永健三位美国科学家，因为在水母中发觉和研究绿色荧光蛋白而取得,年诺贝尔化学奖。,绿色银光蛋白,第2页,GFP,发觉之旅,；,1962,年，下村修首次从维多利亚多管水母,Aequoreavictoria,中分离出,GFP,。他发觉该蛋白在紫外线下会发出明亮绿光。,1992,年，道格拉斯,普瑞舍克隆并测定了水母中绿色荧光蛋白基因。,1993,年，,MartinChalfie,证实了,GFP,作为各种生物学现象发光遗传标识价值。在最初一项试验中，他用,GFP,使秀丽隐杆线虫,6,个单独细胞有了颜色。,1994,年，钱永健开始改造荧光蛋白，培育出黄色、蓝色、绿色、红色等各种颜色荧光蛋白，了解了,GFP,发出荧光机制。世界上当前使用荧光蛋白大多是钱永健试验室改造后变种。令在同一时间跟踪多个不一样生物学过程成为现实。钱永健还开发了检测荧光蛋白荧光探针技术。,绿色银光蛋白,第3页,维多利亚多管水母（,Aequoreavictoria,）,绿色银光蛋白,第4页,GFP,介绍,维多利亚多管水母生活在北太平洋严寒水域。这种水母体内含有一个生物发光蛋白质,aequorin,，它本身发蓝光。,GFP,能把这种光转变成绿色，也就是当水母容光焕发时候咱们实际看到颜色。,GFP,纯溶液在经典室光下呈黄色，不过当被拿到户外阳光下时，它会发出鲜绿颜色。这种蛋白质从阳光中吸收紫外光，然后以能量较低绿光形式发射出来。,绿色银光蛋白,第5页,GFP,结构,蛋白序列,SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFYLQCFARYPDHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSQNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGI,GFP,由,238,个氨基酸残基组成，分子量约为,26.9kDa,。,绿色银光蛋白,第6页,GFP,结构,GFP,结构,绿色银光蛋白,第7页,GFP,结构,绿色银光蛋白,第8页,GFP,结构,GFP,结构,绿色银光蛋白,第9页,GFP,晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长,420 nm,宽,240 nm,由,11,个,片层组成桶状组成疏水中心和由,4,个,螺旋以及其中一个,螺旋包含着发光基团组成,。,GFP,结构,绿色银光蛋白,第10页,GFP,结构,桶顶部由,3,个短垂直片段覆盖,底部由一个短垂直片段覆盖,对荧光活性很主要生色团则位于大空腔内。严密桶形结构保护着荧光基团，预防它被周围环境淬灭。试验表明,GFP,荧光产生前提是桶状结构完整性,去除,N,端,6,个氨基酸或,C,端,9,个氨基酸,GFP,均会失去荧光。这是因为生色团形成效率较低,而且形成过程受外界环境影响较大缘故,绿色银光蛋白,第11页,GFP,结构,GFP,结构,绿色银光蛋白,第12页,GFP,独特结构,由,238,个氨基酸组成,“像一个罐头”,每个单体由,11,个反向平行,-sheets,围绕，,4,个,-helix,组成，其中一个,-helix,位于“罐头”内,大约长,420 nm,宽,240 nm,荧光基团位于关键,-helix,绿色银光蛋白,第13页,GFP,结构,绿色银光蛋白,第14页,由,螺旋含有发光基团由第,65,、,66,、,67,位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团组成。翻译出蛋白质折叠环化之后,在,O 2,存在下,分子内第,67,位甘氨酸酰胺对第,65,位丝氨酸羧基亲核攻击形成第,5,位碳原子咪唑基,第,66,位酪氨酸,2,键脱氢反应之后,造成芳香团与咪唑基结合。这么,GFP,分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程能够自动催化完成。,绿色银光蛋白,第15页,绿色银光蛋白,第16页,1.,两个野生型,GFP,吸收紫外光和蓝光，发射绿光，在,395 nm,出现一个最大吸收峰,在,470 nm,出现一个小吸收。出现两个吸收峰原因可能是因为存在阴性和中性两个不一样化学结构生色团。因为存在两个吸收峰,野生型,GFP,能够被标准长波紫外 源和异硫氰酸荧光素,(fluorescein isothiocyanate,FITC),所激发。,GFP,性质,绿色银光蛋白,第17页,2.,能够在单独或者与其它蛋白融合时产生荧光。而其最显著特点是除了氧气之外，不需要其它辅酶，不需底物。,3.,Baird,等研究人员发觉，即使,GFP,有紧密桶状结构和形成发光基团所必需复杂翻译后修饰，当对,GFP,N,端和,C,端个别交换重排并以一段间隔重新连接时，,GFP,依然含有荧光。而且，,GFP,一些位点能够耐受整段蛋白插入，在结合金属离子黄色荧光蛋白（,Yellow Fluorescent Protein,YFP,，,GFP,突变体）中,145,位插入锌指结构能使荧光强度多倍提升。,绿色银光蛋白,第18页,4.GFP,作为汇报分子含有很多优点，如实现了活细胞内基因表示和定位、荧光为蛋白内在属性、荧光发射无种属依赖性、荧光信号对光漂白含有高抗性、检测时不需要附加辅助因子、在细菌和真核细胞中表示无显著毒性、含有高度稳定性。另外，细胞内,GFP,检测也比较简单，如利用紫外灯、荧光显微镜、荧光激活细胞分选仪等，现有报道利用实时定量,PCR,进行,GFP,荧光定量测定方法。,绿色银光蛋白,第19页,GFP,应用,1.,在蛋白质相互作用和构型改变研究中应用,一个活细胞内蛋白质相互作用研究方法是蛋白质片断互补测定法（,protein-fragment complementation assay,PCA,）。将标识蛋白在某个位点打开，用片断分别标识两个蛋白。假如被标识蛋白质相互作用，则酶或荧光蛋白片断靠近并重新折叠恢复活性。,Hu,等提出了双分子荧光互补试验（,BiFC,）概念，用互补荧光片断标识不一样蛋白来研究,bZIP,和,Rel,转录因子家族相互作用，确定了相互作用位置，信号传递对作用位点调整等。,绿色银光蛋白,第20页,荧光互补不但仅在蛋白质相互作用中有所应用，,Jeong,等研究人员以与底物结合时会有经典构象改变麦芽糖结合蛋白（,MBP,）为模型，将,MBP C,端和,N,端分别与,GFP,片断融合。结果证实加入底物一组显示出比对照组更强荧光，由此提出,split-GFP,在观察蛋白构型改变中应用。,另外，一个主要荧光成像技术,荧光共振能量转移（,fluorescence resonance energy transfer,FRET,）也被广泛应用。它能够利用,GFP,及其突变体青色荧光蛋白（,CFP,）、黄色荧光,蛋白,（,YFP,）等，定时、定量、定位、无损伤地在活细胞内检测大分子构象改变、蛋白之间相互作用、信号传递路径。,绿色银光蛋白,第21页,2.GFP,在信号转导中应用,研究发觉,一些突变,GFP,能够发生荧光共振能量转移（,FRET,），,FRET,对于两个荧光分子相互间定位和距离高度敏感,(,在纳米范围内,),。两个分子间微小线性或空间定位关系破坏能够强烈地改变能量转移效率。经过计算供给分子对于接收分子荧光释放比率来观察细胞动态改变指标。它消除了,GFP,分子在绝对浓度、细胞厚度、激发源能量度以及检测绝对效率等影响。利用,FRET,能够作成,GFP,依赖生物探针,现已经有研究人员设计大分子或分子配对物来改变,GFP,之间原有生理信号反应,FRET,。,绿色银光蛋白,第22页,在上述试验基础上,研究人员设计了,FRET,依赖,Ca 2+,敏感指示剂,该试验发觉,经过改变两个,GFP,之间距离,可增加,FRET,。另有一些研究人员,并没有把两个,GFP,融合在一个单一结构中,而是把一个,GFP,融合到,CaM,上,另一个,GFP,融合到,CaM,结合区域。结果发觉,当,Ca 2+,结合到,CaM,上,出现分子间异源二聚体,两个,GFP,足够靠近而产生,FRET,。这个试验提醒了,FRET,不但能够在分子内发生,而且还可在分子间发生。,绿色银光蛋白,第23页,最近,有学者用,GFP,依赖生物传感器测量活细胞内生化动力学,经过利用带有,GFP,标识蛋白激酶,A,转染细胞,观察相关,cAMP,动态荧光改变。经过融合蓝色荧光,GFP,到调整亚单位或融合绿色荧光,GFP,到,PKA,催化亚单位,设计出了,cAMP,传感器。当,cAMP,浓度很低时,两个荧光分子距离很近,并出现,FRET,假如增加,cAMP,浓度,发生,FRET,可能性急剧下降。利用该方法,能够检测出,cAMP,动态改变,并开创了在整体条件下,研究,cAMP,调整信号转导路径新方法。,绿色银光蛋白,第24页,GFP,结构即使含有高度完整性,不过试验中发觉,在,GFP,中一些确定位置,插入外源基因,完全没有丧失其荧光性。当把,CaM,插入黄色荧光,GFP,突变体中,得到,Ca,2+,传感器,当,Ca,2+,结合到,CaM,上,造成生色团去质子化,使荧光强度增加,7,倍。当在黄色荧光,GFP,中插入一个,Zif268,锌指结构,能够得到传导,Zn,2+,GFP,结果发觉荧光少许增加,为改变前,1.7,倍,K,d,值约,0.4mmol,。插入外源基因致使,GFP,荧光敏感性增强现象,提供了一个获取永久编码传感器去监测细胞信号转导新路径。,绿色银光蛋白,第25页,改进,GFP,应用前景,蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，绿色荧光,蛋白,，黄色荧光蛋白，褐色。,1.,提升了,GFP,光谱性质，,2.,提升荧光强度,3.,提升光稳定性,4.,颜色突变,5.pH,敏感突变体,绿色银光蛋白,第26页,到当前为止,改进荧光蛋白已经有非常广泛应用,如转染细胞确实定,体内基因表示测定,蛋白质分子定位和细胞间分子交流动态监测,免疫分析、核酸碱基探针分析,以及分子间第二信使钙离子和,cAMP,水平指示,细胞间隙,pH,改变检测。另外,GFP,也能够和其它蛋白质形成融合蛋白,作为基因治疗检测指标。但,GFP,在应用中还发觉有许多问题亟待处理,:,(1),荧光信号强度非线性性质使得定量非常困难。,(2),多数生物含有微弱自发荧光现象,并有着类似激发和发射波长,这个荧光背景会影响一些,GFP,检测。,(3),试验中发觉极难建成,GFP,稳定细胞株,可能与,GFP,参加细胞凋亡过程相关。,绿色银光蛋白,第27页,详细研究领域,1,、骨架和细胞分裂,2,、细胞器动力学和泡囊运输,3,、发育生物学,4,、神经生物学,5,、其它应用,6,、,GFP,载体和技术,7,、其它有用,GFP,链接,绿色银光蛋白,第28页,应用,GFP,研究结果,美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”猫,绿色银光蛋白,第29页,杰夫,利希曼利用荧光蛋白展现了大脑内连接，图片中漂亮“彩虹”就是神经系统网络,1997,年在大阪大学降生第一个发光哺乳动物小老鼠,绿色银光蛋白,第30页,两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学试验室,约克镇科技企业生产荧光鱼引入市场，荧光蛋白便快速在商业上得到应用,绿色银光蛋白,第31页,利用,GFP,来创造生理传感器：一个感应离子或酸碱度水平，然后经过发出特征性荧光来汇报结果分子机器。这里所展示分子是一个被修饰过用来感应锌离子浓度蓝色荧光蛋白，当红色锌离子连接到蓝色被修饰过发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍荧光从而形成轻易被检测到可见信号。,绿色银光蛋白,第32页,用不一样“荧光蛋白”让未知世界显影,绿色银光蛋白,第33页,