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细菌基因组DNA的提纯与纯化

姓名 学号 同组人 班级 实验时间

摘要：不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。目前，有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。本次实验选用黄色粘球菌DK1622，使用试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)进行细菌基因组DNA的提纯与纯化，旨在学习并掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法。通过本次实验，我们达到了实验预期，取得了良好的实验效果。
关键词：黄色粘球菌DK1622、基因组DNA、试剂盒法

1.引言
生物的大部分或几乎全部DNA都集中在细胞核或核质体中。真核细胞的DNA主要存在于细胞核中，与蛋白质相结合构成大小不一的染色体。而原核生物的DNA不与任何蛋白质相结合。
基因组DNA的提取一般包括：①破碎细胞；②去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子；③沉淀核酸；④去除盐类、有机溶剂等杂质；⑤纯化干燥；⑥溶解等几个主要步骤。破碎细胞是为了释放DNA，其方法因样本不同而不同，可用反夏冻融、SDS和NaOH处理、蛋白酶和溶菌酶酶解以及超声波破碎等方法。蛋白质对DNA制品的污染常常影响到后续的DNA操作过程，因此，在DNA提取过程中必须把蛋白质除去。一般去除蛋白质常用酚／氯仿抽提法。酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响，经酚／氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相。这种方法对于去除DNA中大量的蛋白质杂质是行之有效的，因此也是DNA纯化中的基本方法。少量的或与DNA紧密结合的蛋白质杂质则可用蛋白酶予以去除。DNA制品中也会有RNA杂质，但RNA极易降解。况且，少量的RNA对DNA操作无大影响，必要时可加入不含DNase的RNase以去除RNA的污染。为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是利用冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心将核酸回收。用70%～80%乙醇洗涤沉淀，可除去沉淀中多余的盐，以避免其对核酸溶解的影响以及对后续步骤的酶促反应的抑制作用。
在进行基因组的大量提取时，利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器的小分子DNA或质粒DNA分离。由于基因组DNA一般都很长，对剪切力十分敏感，提取时容易发生机械断裂，产生大小不同的片段。因此，在基因组DNA提取过程中，为保证得到较长的DNA，应尽量避免以下因素导致的DNA降解：
（1）物理降解。在实际操作时应尽可能轻缓，尽量避免过多的溶液转移和剧烈的振荡等，以减少机械张力对DNA的损伤，同时也应避免过高的温度。此外，操作所用的吸头口不能太小，应剪去尖端部分，使其孔径变大。
（2）细胞内源DNase的作用。细胞内常存在活性很高的DNase，细胞破碎后，DNase便可与DNA接触并使之降解。为了避免DNase的作用，在溶液中常加入EDTA、SDS以及蛋白酶等。EDTA具有螯合Ca2+和Mg2+的作用，而Ca2+和Mg2+是DNase的辅助因子。SDS和蛋白酶则分别具有使蛋白质变性和降解的作用。
（3）化学因素也会降解DNA。例如，过酸的条件下，由于DNA存在腺嘌呤而导致DNA的不稳定，极易在碱基脱落的地方发生断裂。因此，在DNA提取过程中，应避免采用过酸条件。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同。目前，也有许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离到高纯度的DNA。
电泳是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极移动的现象。各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因带电离子的大小、形态及电荷量的不同而有差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如EB染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
溴化乙锭（EB）是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA或RNA分子的碱基之间，并在300 nm波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现凝胶中的核酸分子。在适当的染色条件下，荧光的强度是同DNA片段的大小（或数量）成正比。
核酸在溶液中由于磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面六个因素：
（1）样品DNA分子的大小：电泳时，线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的，其迁移速度与分子量（所含碱基）的对数值成反比，这是因为大分子有更大的摩擦阻力。
（2）DNA分子的构象：分子量相同而构象不同的DNA分子，其迁移速率不同。在抽提质粒DNA过程中，由于各种因素的影响，使超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（cccDNA）的一条链断裂，变成开环DNA（ocDNA）分子，如果两条链发生断裂，就转变为线状DNA（Liner DNA）分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。一般情况下，超螺旋型（cccDNA）迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状（ocDNA）分子。
（3）琼脂糖浓度：琼脂糖浓度直接影响凝胶的孔径，一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的泳动速度不同。通常凝胶浓度愈低，则凝胶孔径愈大，DNA电泳迁移速度越快，即分子量越大，选用的凝胶浓度应越小。
（4）电泳所用电场：低电压条件下，线性DNA片段的迁移速率与所用电压成正比。电压愈高带电颗粒泳动愈快，但随着电场强度增加，高分子量DNA的泳动速率以不同幅度增加，因此凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减小，为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5V/cm。
（5）电泳缓冲液: 在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有：TAE、TBE、TPE和MOPS等。电泳缓冲液的作用：①维持合适的pH。电泳时，正极发生氧化反应（4OH-+4e-→2H2O+O2），负极发生还原反应（4H++4e-→2H2），长时间的电泳将使正极变酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变；②使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01～0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢；太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化；③电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1～2mM，目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。电泳缓冲液的组成和离子强度直接影响迁移率，当电泳液为无离子水（如不慎在凝胶中忘记加缓冲液，即误用蒸馏水配置凝胶），溶液的导电性很少，带电颗粒泳动很慢，DNA几乎不移动；而在高离子强度下（如错用10×电泳缓冲液），导电性极高，带电颗粒泳动很快，产生大量的热，有时甚至熔化凝胶或使DNA变性。
（6）温度：DNA在琼脂糖凝胶电泳中的行为受碱基组成和凝胶温度影响不明显。不同大小DNA片段的相对电泳迁移率在4～30℃内无变化，一般琼脂糖凝胶电泳多在室温下进行，而当琼脂糖含量少于0.5％时凝胶很脆弱，最好在4℃下电泳以增加凝胶强度。
2.材料和方法
2.1 材料和试剂
实验菌株：黄色粘球菌DK1622
实验试剂：试剂盒Bacterial DNA isolation kit(Omega)、TE溶液、BTL buffer、proteinase K溶液、RNase A、BDL buffer、无水乙醇、buffer HB、wash buffer、Elution Buffer、琼脂糖、灭菌双蒸水ddH2O、1×TAE缓冲液、溴化乙锭（EB）溶液、6×上样缓冲液（6/10×loading buffer）
实验仪器：离心机、水浴锅、涡旋振荡器、微量移液器、不同类型的枪头、1.5mL Ep管
2.2 方法
2.2.1试剂盒法提取细菌基因组DNA
（1）将黄色粘球菌培养液倒入1.5mL Ep管中，在离心机中10,000rpm离心2min，弃上清。
（2）重复收集一次，即继续向刚才的1.5mL Ep管中倒入黄色粘球菌培养液，重复以上步骤，使1.5mL Ep管中共收集3.0mL培养液中的菌体。
（3）向菌体沉淀中加入500μL TE，充分涡旋重悬。
（4）将菌液在离心机中10,000rpm离心2min，尽可能吸弃上清。
（5）向菌体沉淀中加入200μL BTL buffer，涡旋重悬。
（6）向菌液中加入25μL proteinase K溶液，涡旋混匀；
（7）将菌液55℃水浴45min，期间每15～20min振荡混匀一次。
（8）向菌液中加入5μL RNase A，颠倒混匀。
（9）将菌液放置在水浴锅中37℃水浴30min。
（10）将菌液在离心机中12,000rpm离心5min。
（11）小心转移上清到一新的Ep管中。
（12）加入220μL BDL buffer，颠倒混匀。
（13）65℃水浴10min。
（14）加入220μL 无水乙醇，充分涡旋，确保没有任何沉淀。
（15）将DNA纯化柱（蓝色）组装到2mL收集管上。
（16）将上述样品全部、小心转移到柱子中。
（17）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（18）将柱子组装到第二个收集管上，加入500μL buffer HB。
（19）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（20）将柱子组装到同一个收集管上，加入700μL wash buffer。
（21）12,000rpm离心1min，弃流出液。
（22）重复洗涤一次，即再加入700μL wash buffer，12,000rpm离心1min，弃流出液。
（23）使用同一收集管，13,000rpm离心2min。
（24）将柱子安装到新的Ep管上，加入50μL 65℃预热的Elution Buffer，室温静置5min。
（25）12,000rpm离心1min，收集DNA。
（26）重复收集一次。
2.2.2琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA
（1）0.8%琼脂糖凝胶的制备。
①正确组装制胶槽、制胶板、样品梳。
②取40mL 1×TAE至250mL干净红盖瓶中，称量0.3g琼脂糖，混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至溶液澄清无颗粒。
③待溶液冷却至60℃左右，加入20μL 1mg/mL的溴化乙锭（EB）溶液，使EB溶液终浓度为0.5μg/mL，混匀后缓缓倒入架好样品梳的制胶槽中，冷却凝固待用（冷却凝固时间要在30min以上）。之后轻轻拔出梳子，放入电泳槽中（电泳槽中事先加入1×TAE电泳缓冲液），即可上样。
（2）电泳上样。
①取1.0μL纯化DNA、4μL双蒸水、1μL上样缓冲液（6/10×loading buffer），用微量移液器吹吸混匀。
②将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm。
③将上述混合好的DNA样品，按照表1顺序，点样到凝胶中。
（3）凝胶电泳与DNA分离。
①开启电泳仪电源 。
②选择合适的电压（120V）和时间（40min）。
③将电泳槽电极与电泳仪连接。电泳槽红色电极为正极，与电泳仪正极相连。电泳槽黑色电极为负极，与电泳仪负极相连。
④启动电泳，待观察到负极有气泡升起方可离开。
⑤电泳结束，关闭电源，取出凝胶。
⑥紫外灯下观察电泳结果，摄片，保存，分析。

表1 DNA样品加样顺序

泳道
1
2
3
4
5
6
7
样品
λ DNA
λ/Hind Ⅲ
1组DNA样品
2组DNA样品
3组DNA样品
4组DNA样品
5组DNA样品
样量
5μL
5μL
6μL
6μL
6μL
6μL
6μL
泳道
8
9
10
11
12
13
14
样品
DL 2000
6组DNA样品
7组DNA样品
8组DNA样品
9组DNA样品
10组DNA样品
λ/Hind Ⅲ
样量
5μL
6μL
6μL
6μL
6μL
6μL
5μL

3.结果

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
bp

9,416
6,557
4,361

2,322
2,027
图1. 试剂盒法提取细菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳

（1）λ DNA、λ/Hind Ⅲ、DL 2000的作用是marker。这些marker都是线形DNA。细菌基因组DNA在细菌体内呈环形，经实验提取后呈线形。提取得到的细菌基因组DNA应该越完整越好。
（2）本实验选用的琼脂糖凝胶浓度为0.8%，DNA片段有效分离范围大约是0.2～20kb，DNA片段如果大于20kb将无法分开从而导致DNA片段堆积在一起。在此次实验中，提取得到的细菌基因组DNA大小大于20Kb，因此DNA片段堆积。泳道5是我们组做到实验结果，可见图中箭头所指位置即使我们组提取得到的细菌基因组DNA条带。另外我们组得到的DNA条带较浅，是因为我们组收集的黄色粘球菌菌体量较少。
（3）泳道1加的样品λ DNA是原始DNA，大小为48Kb，该片段较大，在0.8%琼脂糖凝胶中无法分辨出来。在普通电泳中无法分辨出DNA大片段。
（4）泳道2加的样品是λ/Hind Ⅲ。Hind Ⅲ是限制性核酸内切酶，可以酶切λ DNA。λ DNA是线形DNA，其上含有7个Hind Ⅲ酶切位点，因此Hind Ⅲ将λ DNA酶切成8个DNA片段。这8个DNA片段大小分别是125bp、564bp、2,027bp、2,322bp、4,361bp、6,557bp、9,416bp、23,130bp。最小的DNA片段是125bp，最大的DNA是23,130bp。23,130bp的DNA片段已经超出0.8%琼脂糖凝胶的有效分辨范围，所以该DNA片段会发生堆积的现象。在该样品中，虽然各种DNA片段分子数一样，但是DNA片段的摩尔质量不同，所以导致DNA片段质量不同。所以在泳道2的DNA电泳图中两个DNA小片段（125bp和564bp）观察不到，而较大的DNA片段可以很明显地观察到。如果想观察到小片段，可以多加样品。另外由于DNA带负点而EB带正电，电泳时DNA向正极移动而EB向负极移动。泳道2的样品λ/Hind Ⅲ中两个DNA小片段（125bp和564bp）相对分子质量较小，电泳迁移速率较快，EB向正极迁移导致电泳结束后这两个DNA小片段所处的凝胶位置EB浓度较小，DNA染色不明显。
（5）泳道2的样品量与泳道1的相等（均是5μL），但是泳道2的DNA条带要比泳道1的亮，是因为泳道2的DNA浓度较大。
（6）某些点样孔的边缘（尤其是下边缘）出现荧光，泳道4、泳道6、泳道7等对应的点样孔下边缘可明显观察到此现象。该现象说明这些提取的细菌基因组DNA中含有残留的蛋白质，蛋白质与DNA交联在一起，而蛋白质与DNA迁移方向相反，导致蛋白质阻碍了部分DNA泳动，从而在点样孔的边缘形成荧光。另外在这些点样孔下边缘的下方还有一条DNA条带，这是由于提取的样品中某些DNA片段太大从而迁移速度过慢产生的。
（7）某些DNA条带是弯曲的（“微笑”条带），泳道2、泳道14的DNA电泳图中处于靠上位置的“微笑”条带很明显，其形成原因有两个：第一，加样孔不是规则的长方体形（在0.8%琼脂糖凝胶制备过程中拔梳子的时候梳子可能导致加样孔损坏）；第二，上样量多。
（8）泳道8加的样品是DL 2000，从上往下可以看到6条DNA条带，对应的DNA片段大小分别是2kb、1kb、750bp、、500bp、250bp、100bp。DL 2000中样品中较小的DNA片段（250bp和100bp）电泳迁移速率较快，电泳时EB向正极迁移导致电泳结束后DNA小片段所处的凝胶位置EB浓度较小，DNA染色不明显。
4.讨论
（1）此次实验中细菌选用的是黄色粘球菌DK1622，其特性是：基因组全长9.13Mb，代时4小时，胞外基质富含粘多糖。黄色粘球菌菌液呈黄色，是因为黄色粘球菌含有黄色色素。
（2）黄色粘球菌菌体收集过程中也可以将黄色粘球菌培养液倒入2个1.5mL Ep管中，其他操作不变，同时收集个2个Ep管中的菌体，最后加入TE重悬后合并。TE溶液是pH缓冲液，含有10mM Tris-HCl（pH 8.0）、1mM EDTA，呈弱碱性，有利于保护碱基对，为DNA提供稳定的生理状态。同时TE溶液含有EDTA，EDTA可抑制DNA酶的作用。
（3）加入BTL buffer后菌液变清亮而且有气泡产生。BTL buffer的作用：①buffer里面含有SDS，SDS的作用是裂解菌体；②buffer里面含有核酸酶抑制剂，可以抑制DNA酶的活性；③buffer还要调节菌液的pH值使pH值达到proteinase K最适pH值。
（4）黄色粘球菌菌体的裂解实验步骤的前两步的目的是将不溶性细胞碎片以离心方式沉淀，如果实验过程中发现没有细胞碎片则可以不做这两步。
（5）黄色粘球菌菌体的裂解实验步骤中“（3）加入220μL BDL buffer，颠倒混匀”的目的是使蛋白质在高盐溶液中盐析形成沉淀，而DNA仍溶解在溶液中，但在低盐溶液中DNA不溶而蛋白质溶；“（4）65℃水浴10min”的目的是促进DNA溶解；“（8）12,000rpm离心1min”的目的是使DNA与纯化柱结合；“（14）使用同一收集管，13,000rpm离心2min”的目的是去除残留的乙醇；“（16）12,000rpm离心1min”的目的是收集DNA。
（6）在上次实验“质粒DNA的提取、纯化和电泳检测”中，质粒DNA的相对分子质量较小，所选用的琼脂糖凝胶浓度是1%。而在这次实验中，细菌基因组DNA的相对分子质量较大。而DNA相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。因此本实验所选用的琼脂糖凝胶浓度应该减小，所以实验中选用的琼脂糖凝胶浓度为0.8%。琼脂糖凝胶浓度没有选得更小是因为当琼脂糖凝胶浓度小于0.6%时会使胶很脆，不容易从制胶板中拿出来，增加实验操作的困难性。
（7）核酸分离纯化的总原则：第一，保证核酸一级结构的完整性；第二，排除其他分子的污染。
（8）在使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。
（9）应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，影响琼脂糖浓度。对于琼脂糖溶液来说，如果胶液温度过高，会使制胶板、制胶槽、样品梳变性，从而影响胶孔大小和胶形状，间接影响加样量和跑条带。如果胶液温度过低，琼脂糖凝胶会凝固，所以在胶液冷却至60℃左右倒胶。胶液冷却至60℃左右后需要加EB，EB是一种强烈的诱变剂，应戴手套进行操作。制胶的时候要除去气泡。
（10）凝胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要垂直向上，不要弄坏点样。拔梳子的时候要特别小心，以防凝胶与支持物脱离。
（11）电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳效果。配制琼脂糖凝胶的电泳缓冲液应与电泳时使用的缓冲液为同一批配制的。注意使电泳槽中1×TAE缓冲液高于琼脂糖凝胶约1mm。
（12）DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动，因此点样孔在负极。电泳上样时要小心操作，枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。同时不要快速挤出吸头内的样品，一是为了避免产生气泡，二是为了避免挤出的空气将样品冲出样品孔。跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散。加样后不要再移动电泳槽。
（13）DNA带负点而EB带正电，电泳时DNA向正极移动而EB向负极移动。EB要加到0.8%琼脂糖凝胶中，而不要将EB与DNA样品混合加到点样孔中。否则DNA会从加样孔向正极迁移而EB会从加样孔向负极迁移导致DNA与EB分离，使EB无法与DNA结合。
（14）上样缓冲液（loading buffer）含有30%甘油、0.25%溴酚蓝（BPB）、0.25%二甲苯箐FF。甘油的作用是增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内。溴酚蓝及二甲苯箐作为双色电泳指示剂，使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使加样操作更为便利，另外可以在电场中预测速率。注意在上样缓冲液中是有2种颜色指示剂的，即溴酚蓝（大小是0.6Kb）和二甲苯箐（大小是2kb）。如果只有一种颜色指示剂那就有溴酚蓝。
（15）在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。因此，该法还可用于相对分子质量的测定。将未知相对分子质量的DNA样品与已知相对分子质量的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以获得该样品的相对分子质量的大小。
（16）紫外线对眼睛和皮肤均有危害性，对眼睛尤甚。为了最大限度避免受到辐射，要确保紫外光源得到适当遮蔽，并应戴好目镜（眼罩）或能够有效阻挡紫外线的全副完全罩，避免皮肤直接暴露在紫外线下。

参考文献

［1］ 汪天虹.分子生物学实验. 北京：北京大学出版社，2009年.