核酸分子杂交专家讲座.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,核酸分子杂交,Nucleic Acid,Hybridization,核酸分子杂交专家讲座,第1页,2,1.,Basic principle of nucleic acid hybridization,2.,Basic method of nucleic acid hybridization,3.,Biochip Technology,4.,Preparation&label of nucleic acid probes,5.,Factors of,nucleic acid hybridization,Contents,核酸分子杂交专家讲座,第2页,3,核酸分子杂交技术发展史,Hall,等,1961,年工作开始，探针与靶序列在溶液中杂交，经过平衡密度梯度离心分离杂交体。,Bolton,等,1962,年设计了第一个简单固相杂交方法，称为,DNA-,琼脂技术。,60,年代末，,Britten,等研究液相中,DNA,复性以比较不一样起源核酸复杂度，用,UV260nm,吸光度来监测互补链复性程度。,60,年代中期,Nygaard,等将,DNA,或,RNA,探针固定在硝酸纤维素（,NC,）膜上。,Brown,等应用这一技术评定了爪蟾,rRNA,基因拷贝数。是当代膜杂交试验基础。,固相化学技术和核酸自动合成仪诞生。,70,年代末期到,80,年代早期，分子克隆成为可能。能够从基因组,DNA,文库和,cDNA,文库中取得特定基因克隆，制备大量探针,DNA,。,1975,年英国爱丁堡大学,Southern,建立了,Southern,印记杂交技术，用于转化子分析。,核酸分子杂交专家讲座,第3页,4,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993.,for their discoveries of split genes,年上海交通大学微生物研究所,核酸分子杂交专家讲座,第4页,5,DNA,mRNA,法国科学家,Chambon,遗憾,hybridization electron micrograph of Ovalbumin mRNA and DNA,核酸分子杂交专家讲座,第5页,6,Ovalbumin gene,hnRNA,modification,Splicing of hnRNA,Mature mRNA,核酸分子杂交专家讲座,第6页,7,Section I,Basic principle of nucleic acid hybridization,核酸分子杂交专家讲座,第7页,8,denaturation,renaturation,核酸分子杂交是基于核酸分子变性和复性原理基础上产生和发展起来。,核酸分子杂交专家讲座,第8页,9,DNA,变性是指在物理或化学原因作用下，,DNA,分子互补碱基对之间氢键断裂，使双链,DNA,分子变成两条单链,DNA,过程。,I.Denaturation&renaturation of DNA,核酸分子杂交专家讲座,第9页,10,1.,Factors that cause DNA denaturation,酸,碱,热,变性剂,（尿素,酰胺）,有机溶剂,（乙醇,丙酮）,核酸分子杂交专家讲座,第10页,11,2.changes in physical and chemical properties of denatured DNA,Hyperchromic effect,粘度下降浮力上升,核酸分子杂交专家讲座,第11页,12,（,nm,）,A,82,OD,260,（,A,260,）,光密度（,OD,）亦称光吸收值（,A,）,增色效应,：,DNA,变性时，其溶液,OD,260,增高。,Hyperchromic effect,is the increase of OD,260,of a material that occurs when the DNA duplex is denatured.,核酸分子杂交专家讲座,第12页,13,OD,260,应用,核酸浓度测定,核酸纯度测定,dsDNA,：,1 OD,260,=50ug/ml,ssDNA/RNA,：,1 OD,260,=40ug/ml,寡核苷酸,：,1 OD,260,=20ug/ml,DNA,OD,260,OD,280,=1.8,2.0,2.0,RNA,污染,2.2,降解为核苷酸,1.7,蛋白质、酚污染,核酸分子杂交专家讲座,第13页,14,Tm,：双链,DNA,变性二分之一所需要温度称为解链温度或融解温度（,melting temperature,Tm,）。,不一样,DNA,含有不一样,Tm,值，普通为,8590,，其大小与,G+C,含量成正比。,Tm=,（,G+C,）,%0.41+69.3,Thermal denaturation,核酸分子杂交专家讲座,第14页,15,PCR,热变性温度，普通为,9397,。,核酸分子杂交专家讲座,第15页,16,变性,DNA,在适当条件下，两条互补链可恢复天然双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应：,DNA,复性时，其溶液,OD,260,降低。,3.Renaturation of DNA,Hypochromic effect,is the decrease of OD,260,of a material that occurs when the DNA is renatured.,核酸分子杂交专家讲座,第16页,17,Base pairing of DNA renaturation,核酸分子杂交专家讲座,第17页,18,DNA,浓度,DNA,片段大小,DNA,片段复杂性,适当复性温度 适当离子强度,影响复性速度原因：,核酸分子杂交专家讲座,第18页,19,II.,核酸分子杂交,不一样起源,含有互补序列两条核酸单链在一定条件下按碱基配对标准形成双链过程。,DNA-DNADNA-RNARNA-RNA,探针,待测核酸,分类,核酸分子杂交专家讲座,第19页,20,DNA-DNA,杂交双链分子,变性,复性,DNA-RNA,杂交双链分子,RNA-RNA,杂交双链分子,寡核苷酸,-DNA,或,RNA,杂交双链分子,核酸分子杂交专家讲座,第20页,21,核酸分子杂交技术基本原理,有互补特定核苷酸序列单链,DNA,或,RNA,混在一起时，其对应同源区段将会退火形成双链结构。,如把一段已知基因（,DNA,或,RNA,）核酸序列用适当标识物（如放射性同位素、生物素等）给予标识，看成探针（,probe),与变性后单链,DNA,或,RNA,进行杂交。,再用适当方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标识物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表示丰度等。,核酸分子杂交专家讲座,第21页,22,应 用,：,(1),检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；,(2),用来揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷贝数及表示丰度。,核酸分子杂交专家讲座,第22页,23,第 二 节,核酸分子杂交基本方法,核酸分子杂交专家讲座,第23页,24,液相杂交,固相杂交,原位杂交,Southern blot,（检测,DNA,）,Northern blot,（检测,RNA,）,斑点杂交,/,狭缝杂交,核酸分子杂交专家讲座,第24页,25,三种印迹技术比较,Southern blot,Northern blot,Western blot,核酸分子杂交专家讲座,第25页,26,是指将电泳分离、原位变性单链,DNA,片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测,DNA,方法。,一、,Southern,Blot,核酸分子杂交专家讲座,第26页,27,带有,DNA,片段凝胶,DNA,分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转膜,杂交、显影,凝胶,滤膜,（尼龙膜,/,硝酸纤维素膜）,吸附有,DNA,片段膜,Southern,印迹杂交技术流程,胶内变性,核酸分子杂交专家讲座,第27页,28,基本步骤,DNA,制备、酶切,电泳分离,原位,DNA,变性,DNA,转膜,预杂交、杂交、洗脱,杂交结果检测,（二）待测,DNA,样品电泳分离,（三）凝胶中核酸变性,（四）,Southern,转膜,（一）待测核酸样品制备,（五）,Southern,杂交,（六）杂交结果检测,核酸分子杂交专家讲座,第28页,29,细胞,组织,化学试剂,裂解细胞,匀浆器,研磨破碎组织中细胞,蛋白酶、,RNA,酶,消化大部分蛋白质和,RNA,酚,/,氯仿,除去残余蛋白质,DNA,（,100 kb,）,乙醇,（一）待测核酸样品制备,核酸分子杂交专家讲座,第29页,30,部分消化,充分消化,限制酶消化,E,E,E,E,E,E,H,H,DNA,片段：,（最长,DNA,片段控制在大约,2 kb,）,核酸分子杂交专家讲座,第30页,31,1000,500,250,100,750,1,2,1,：,DNA marker,2,：试验组（,EcoR I,）,0.8 1,非变性琼脂糖凝胶,（二）待测,DNA,样品电泳分离,核酸分子杂交专家讲座,第31页,32,碱变性：,DNA,原位变性，形成单链分子，,方便进行分子杂交。,酸中和：凝胶,pH,值恢复中性，,方便,DNA,片段转移。,（三）凝胶中核酸变性,核酸分子杂交专家讲座,第32页,33,（四）,Southern,转膜及固定,（,250-500g,）,毛细管虹吸印迹法,毛细转移,真空转移,电转移,核酸分子杂交专家讲座,第33页,34,核酸分子杂交专家讲座,第34页,35,核酸分子杂交专家讲座,第35页,36,转移后,，各个,DNA,片段在膜上相对位置与在凝胶中相对位置依然一样，因而称为印迹（,blot,）。,琼脂糖凝胶,硝酸纤维素膜,印迹（,blot,）,注意：做好点样方向标识,核酸分子杂交专家讲座,第36页,37,预杂交：,目标是将膜上全部能与,DNA,结合位点,全部封闭，降低本底，使背景清楚洁净。,甲酰胺,20 SSC,Denhardt,氏溶液,鲑精,DNA,SDS,杂交：,预杂交液,+,探针,DNA,（六）,Southern,杂交,预杂交液,（五）探针制备,核酸分子杂交专家讲座,第37页,38,洗膜：,高,低,1SSC:Na,+,浓度,0.2 mol/L,2SSC:Na,+,浓度,0.4 mol/L,0.2SSC:Na,+,浓度,0.04 mol/L,0.1SSC:Na,+,浓度,0.02 mol/L,Na,+,浓度,除去：,未反应探针,与滤膜疏松结合探针,非特异性结合探针,核酸分子杂交专家讲座,第38页,39,X-ray,片,杂交膜,放射自显影,（七）杂交结果检测,非放射性杂化分子检测,核酸分子杂交专家讲座,第39页,40,DNA,分子杂交应用,:,可进行,DNA,片段定位和分子量测定,可用于基因酶切图谱分析、基因突变分析,可用于检出特异,DNA,片段,可用于基因文库和,cDNA,文库筛选,核酸分子杂交专家讲座,第40页,41,分子杂交试验流程,核酸分子杂交专家讲座,第41页,42,是指待测,RNA,样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标识核酸探针进行固,-,液相杂交，检测,RNA,（,mRNA,）方法。,二、,Northern Blot,样品是,RNA,。,电泳前，不酶切。,电泳前，样品变性。,电泳过程中，样品保持变性状态。,电泳后，样品不再变性，直接转膜。,需要尤其注意预防,RNA,被降解。全部器皿都要进行处理，尽可能除尽,RNA,酶。,核酸分子杂交专家讲座,第42页,43,三、,Western blotting,核酸分子杂交专家讲座,第43页,44,将,RNA,或,DNA,变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采取特定探针,进行杂交，这种杂交方法称为,斑点杂交（,dot blotting,）,或,狭缝杂交（,slot blotting,）,。,四、斑点及狭缝杂交,核酸分子杂交专家讲座,第44页,45,多孔过滤加样器,加样板,支撑板,抽真空板,接真空泵,印迹为圆形，称为斑点印迹,印迹为线状，称为狭缝印迹,核酸分子杂交专家讲座,第45页,46,正常对照组,试验组,1,试验组,2,试验组,3,用于特定基因表示定性及定量研究,用于基因突变分析,核酸分子杂交专家讲座,第46页,47,标识探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其进行检测一个方法,称原位杂交,。,五、原位杂交,（,in situ hybridization,）,检测基因在细胞内表示与定位,检测染色体中特定基因位置等,可用于基因克隆筛选菌落原位杂交,(,裂菌,),核酸分子杂交专家讲座,第47页,48,基本步骤：,原位杂交分为：,组织、细胞固定,预处理,预杂交、杂交,杂交结果检测,细胞内原位杂交和组织切片原位杂交,（,10,甲醛等）,（蛋白酶、,SDS,、,Triton X-100,）,（核素和非核素标识探针）,核酸分子杂交专家讲座,第48页,49,菌落原位杂交,核酸分子杂交专家讲座,第49页,50,核酸分子杂交专家讲座,第50页,51,HPV,FISH,荧光原位杂交,(Fluorescence in situ Hybridization),人类染色体端粒,DNA,荧光原位杂交照片,核酸分子杂交专家讲座,第51页,52,三种印迹技术比较,Southern blot,Northern blot,Western blot,胶内变性,上样前变性,上样前变性,变性胶,预杂交,-,核酸分子杂交专家讲座,第52页,53,第 三 节,生物芯片技术,核酸分子杂交专家讲座,第53页,54,生物芯片,生物芯片（,biochip,）是近年来在生命科学领域中快速发展起来一项高新技术，主要是指经过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建,微型生物化学分析系统,，以实现对细胞、蛋白质、,DNA,及其它生物组分准确、快速与,大信息量,检测。,核酸分子杂交专家讲座,第54页,55,DNA,芯片蛋白质芯片其它芯片,生物芯片包含：,按用途分：,-,样品制备芯片,-,生化反应芯片,-,检测芯片,核酸分子杂交专家讲座,第55页,56,是指将许多,特定,DNA,片段,有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上，然后与,待测荧光标识样品,进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，经过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析，从而快速得出,定性和定量,结果。该技术亦被称作,DNA,微阵列,(DNA microarray),。,一、基因芯片,基因芯片,(gene chip),核酸分子杂交专家讲座,第56页,57,基因芯片,(gene chip),Cy3,Cy5,核酸分子杂交专家讲座,第57页,58,许多特定,DNA,片段或,cDNA,片段作为探针,Cy3,Cy5,核酸分子杂交专家讲座,第58页,59,核酸分子杂交专家讲座,第59页,60,芯片制作工艺流程图（,光引导原位聚合技术,）,核酸分子杂交专家讲座,第60页,61,生物芯片研究总流程图,主要基因芯片生产厂商：,Affymetrix,企业,Clontech,企业,Panomics,企业,核酸分子杂交专家讲座,第61页,62,是将高度密集排列蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕捉样品中靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析一个技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间亲和反应,蛋白质芯片,(protein chip),蛋白质芯片,作用原理,核酸分子杂交专家讲座,第62页,63,蛋白质芯片,(protein chip),抗原芯片原理图,核酸分子杂交专家讲座,第63页,64,第 四 节,探针制备与标识,核酸分子杂交专家讲座,第64页,65,核酸探针（,probe,）：,探针是指带有检测标识，能与被检测核苷酸片段互补一段已知核苷酸片段。,cDNA,探针,基因组,DNA,探针,寡核苷酸探针,RNA,探针,探针种类：,核酸分子杂交专家讲座,第65页,66,一,、,合成寡核苷酸探针注意标准,(1),长度（,10-50 bp);,(2)G:C,对含量,40%-60%,；,(3),探针内防止互补；,(4),防止同一碱基连续出现；,(5),与非靶序列有,70%,以上同源性或连续,8,个以上碱基序列相同，最好不用。,核酸分子杂交专家讲座,第66页,67,(1),标识前后探针基本结构、化学性质相同,;,(2),特异性强、本底低、重复性好；,(3),操作简单、节时；,(4),安全、无环境污染。,二、标识物,1,、,一个理想标识物应满足：,核酸分子杂交专家讲座,第67页,68,2,、,标识物种类,32,P,、,35,S,、,3,H,、,125,I,等,半抗原：生物素（,biotin,）,、,地高辛（,Dig,）,荧光素：异硫氰酸荧光素（,FITC,）,、,罗丹明等,酶：辣根过氧化物酶,、,碱性磷酸酶等,化学发光探针：,增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性 磷酸酶催化,1,，,2-,二氧环己烷发光体系,非核素标识物,核素标识物,核酸分子杂交专家讲座,第68页,69,体 内 标 记,体 外 标 记,化 学 法,酶 法,三、标识方法,缺口平移法,随机引物标识法,PCR,标识法,末端标识法,核酸分子杂交专家讲座,第69页,70,利用标识物分子上活性基团与探针分子上基团（如磷酸基团）发生化学反应,将标识物直接结合到探针分子上,。,化学法：,多聚体乙撑亚胺,聚苯醌,酶（如,HRP,）,交联,多聚体乙撑亚胺,酶,DNA,戊二醛,交联,核酸分子杂交专家讲座,第70页,71,酶 法：,OH,5,5,3,32,P-dATP,生物素,-dUTP orNTP,地高辛,-dUTP orNTP,荧光素,-dNTP,核酸分子杂交专家讲座,第71页,72,DNase I,5,5,3,3,5,5,3,3,DNA,聚合酶,5-3,外切酶活力,5,5,3,3,DNA,聚合酶,5-3,聚合酶活力,5,5,3,3,（一）缺口平移法,-,32,PdATP,核酸分子杂交专家讲座,第72页,73,5,3,5,5,3,3,5,3,3,5,5,3,模板,变性,合成标识,Klenow,酶,（二）随机引物法,核酸分子杂交专家讲座,第73页,74,在,PCR,反应底物中，将一个,dNTP,换成标识物标识,dNTP,，这么，标识,dNTP,就可在,PCR,反应同时掺入到新合成,DNA,链上。,dCTP,dGTP,dTTP,dATP,-,32,-,5,3,5,3,底 物,引物,模 板,（三）,PCR,标识法,核酸分子杂交专家讲座,第74页,75,只将标识物标识在,DNA,链,3,末,端和,5,末,端方法,称为末端标识,。,3,端,DNA,末端标识,5,端,DNA,末端标识,（四）末端标识法,核酸分子杂交专家讲座,第75页,76,3,端,DNA,末端标识,核酸分子杂交专家讲座,第76页,77,T,4,噬菌体多苷酸激酶,5,端,DNA,末端标识,-,32,PdATP,先用碱性磷酸酶切除,DNA,双链分子或,RNA,单链,5,末端磷酸基团，使其成为,5-OH,核酸分子杂交专家讲座,第77页,78,1,乙醇沉淀法,2,Sephadex G-50,柱层析法,3,微柱离心法,四、探针纯化,核酸分子杂交专家讲座,第78页,79,第 五 节,影响核酸分子杂交基本原因,核酸分子杂交专家讲座,第79页,80,核酸分子浓度和长度,：,50,300 bp,0.1,0.5,g,2.,温度,:Tm-25,3.,离子强度,:Na,+,浓度约为,1 mol/L,4.,杂交液中甲酰胺,:50%,甲酰胺,降低,Tm,5.,核酸分子复杂性,6.,非特异性杂交反应,:,封闭,影响杂交原因,核酸分子杂交专家讲座,第80页,