微生物工程发酵菌种制备原理与技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/1/3,#,2.1,发酵工业微生物菌种,2.1.1,概述,菌种是微生物工程的核心；,选育、保藏、复壮,2.1.2,发酵工业常用微生物种类,细菌,主要生产氨基酸、核酸、酶、多糖、有机酸等,常用菌种：,Escherichia coli,;,Bacillus subtilis,;,Lactobacillus lactis,;,Corynebacterium glutamicum,放线菌,主要生产抗生素、某些特定的酶；,常用菌种：,Streptomyces lividans,;,S.coelicolor,;,S.hygroscopicus,;,Micromonospora echinospora,;,Actinoplanes ferrugineus,;,酵母,主要生产酒精、有机酸、单细胞蛋白,常用菌种：,Saccaromyces cerevisiae,Pichia pastoris,Candida glabrata,C.tropicals,Phaffia rhodozyma,Yarrowia lipolitica,霉菌,主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素；,Penicillium chrysogenum,Aspergillus niger,A.oryzae,Rhizopus oryzae,2.1.3,发酵工业微生物的基本要求,遗传稳定,易于产生繁殖体,必须是纯种或明确的少数几种菌组成的简单混菌系统，不应带有杂菌及噬菌体；,种子的生长必须旺盛、迅速；,产生所需产物的时间短；,容易分离提纯；,有自身保护机制，抵抗杂菌和噬菌体污染的能力强；,能保持较长的良好经济性能；,菌株对诱变剂处理比较敏感，可能选育出高产的菌株；,菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素,2.1.4,菌种的制备原理和方法,菌株获得的主要方法：,向菌种保藏机构索取；,从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处：,经济性,指导性,从自然界分离筛选；,从某些发酵制品中分离；,从自然界筛选目标菌株的方法与步骤,含微生物样品的采集,（含微生物样品的富集培养）,微生物的分离,野生型目的菌株的筛选,鉴定,微生物的分离,稀释涂布法,划线法；,生化反应法；,高温下培养：,分离嗜热细菌；,培养基中不含,N：,分离固氮菌；,培养基加抗生素,：,分离抗性菌；,组织分离法,合理的筛选策略是关键！,氨基酸产生菌的筛选,样品,分离,初筛（除真菌）,在分离平板上生长获得多个单菌落,复印平板（,copy,法）,平板培养，其中有产生氨基酸,的菌落分泌氨基酸,对应到,copy,前相应,u.v,线杀死长好的菌落,位置，找到目的菌落,再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂,培养后,产氨基酸菌落周围有生长圈,目的菌落进行液体培养，,对产物进行定量测定,筛选产物含量高的菌株,对产物进行菌种筛选时，有两条经验,：,进化上向上兼容；,次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上更有筛选意义,evolution,通过人工措施使微生物逐步适应某一条件，而定向选育微生物的方法；,（柠檬酸）,2.1.6,菌种的保藏,保藏、退化、复壮,菌种的退化和防止,菌种退化：菌株由于移接传代或保藏之后，群体中某些生理特征或形态特征逐渐减退或完全丧失的现象，主要表现为生长速度变慢和目标产物生产能力的下降；,防止退化的方法：,尽量减少传代；,经常进行纯化；,创造良好的培养条件；,单核细胞的移植传代；,采用有效的保藏方法；,菌种的复壮,在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找到尚未衰退的个体，以达到恢复该菌种原有性状的措施；,方法：纯种分离（单细胞分离）；,淘汰法；,寄生体内复壮法；,工业微生物菌种的保藏,不死、不变、不乱；,斜面保藏法,4,；,非长期保存；,1-3,个月需传代，可传,3-4,代；,液体石蜡油保藏法；,尤其适用于丝状担子菌；,一般存活期为,5,7,年，有的可以达到,10,年以上，但以,2,3,年转管,冷冻干燥保藏法；,5-10,年，不适合丝状真菌；,液氮超低温保藏法；,-196,；,甘油低温保存：,15%,甘油，,-80,；,2.2,微生物诱变育种,2.2.1,诱变育种目的,提高目的物产量；,改善菌种特性、提高产物质量；,简化工艺条件；,开发新品种；,2.2.2,诱变育种基本步骤,出发菌株,original strain,的选择,:,具备一定生产能力或某种有利性状；,纯种；,已发生过其他突变；,对诱变剂敏感的增变变异株；,出发菌株的纯化,单细胞悬液的制备；,诱变剂及诱变剂量的选择,诱变处理方式（单因子、复合因子）,诱变菌株的筛选,高通量筛选技术：,2.3,微生物原生质体育种,和基因组改组育种,2.3.1,原生质体的特征,对外界变化更敏感；,对诱变剂更敏感；,对某些噬菌体失去敏感；,2.3.2,微生物原生质体再生育种,出发菌株的选择,菌体的活化,原生质体的制备,原生质体再生,菌株的分离,筛选,原生质体的制备：酶解法,预处理：,细菌（青霉素）；放线菌（甘氨酸）；,霉菌（脂肪酶）；酵母菌（,EDTA,或巯基乙醇）,置于稳定剂中；,酶的选择：,放线菌、细菌（溶菌酶）,霉菌（蜗牛酶或纤维素酶）,酵母（蜗牛酶或葡聚糖酶）,原生质体再生（细胞壁）,双层平板上，半固体培养基中；,2.3.3,微生物原生质体诱变育种,原生质体技术诱变育种技术,出发菌株的选择,菌体的活化,原生质体的制备,诱变育种,原生质体再生,菌株的分离,筛选,2.3.4,微生物原生质体转化技术,整条染色体,DNA,、片段,DNA,或者质粒,DNA,转化原生质体获得转化子的育种技术；,出发菌株的选择,菌体的活化,原生质体的制备,转化,原生质体再生,菌株的分离,筛选,2.3.5,微生物原生质体融合技术,用物理、化学或生物学的方法处理两亲株原生质体，促使其融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，通过筛选而得到集二者优良性状于一体的稳定融合子；,出发菌株的选择,（具有较大遗传差异的近亲菌株）,菌体的活化,原生质体的制备,原生质体融合,原生质体再生,菌株的分离,筛选,原生质体融合,两亲株原生质体混合于高渗透压的稳定剂中，在促融剂的诱导作用下，接触融合成,异核体,，经核融合成,杂合二倍体,，再经染色体交换产生重组体，称,融合子,；,物理方法：电融合、激光融合,化学方法：,PEG,（,1000-6000,分子量）,2.3.6,基因组该组育种,在微生物全基因组改造中快速进行特定群体的基因交换重组，从而增加群体遗传多样性，改良群体中个体性能等的连续遗传改变及表型选择过程；,人工诱变,+,原生质体融合,2.4,微生物的基因工程育种,2.4.1,基因工程育种是指重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌（细胞），实现遗传物质的重新组合，并使得目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术；,主要步骤：,目标,DNA,的获得,目的基因与载体的重组,将重组基因转入宿主细胞,重组子的筛选,