铁皮石斛多糖.doc

西南林业大学

本科毕业（设计）论文
（2013 届）

题 目 组培铁皮石斛多糖的提取及其抗氧化性研究(1)

教学院系 林学院 专 业 食品科学与工程

学生姓名 董 燕 平

指导教师 刘 云（实验师）
唐军荣（实验师）
评 阅 人

二0一三年一月十四日

摘 要
组培铁皮石斛多糖的提取及其抗氧化性研究(1)

董燕平
(西南林业大学林学院，云南 昆明，650224)

摘 要：本试验通过对从组培铁皮石斛中提取出的多糖及维生素c进行了总抗氧化能力的测定和对不同自由基清除率的测定，结果表明，不同样品均具有一定的抗氧化能力，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(DPPH)均具有良好的清除作用。其中，加入组培铁皮石斛多糖60μg时，其对羟基自由基清除率能达到91.4%，对超氧阴离子自由基的抑制率最高达47.08%；当加入组培铁皮石斛多糖700μg时，对DPPH的清除率达到51.91%。
关键词：组培铁皮石斛；多糖；提取；抗氧化

Extraction of Polysaccharides from Tissue Cultivation of Dendrobium Candidum and Research of Its Antioxidation(1)

DONG Yan-ping
(Southwest forestry University Forest Institute,Kunming,Yunnan 650224)
Abstract:In this experiment,the polysaccharides was extracted from Tissue cultivation of Dendrobium Candidum,then the total antioxidation ability and the scavenging rate for different free radical of polysaccharides of Tissue cultivation of Dendrobium Candidum and Vitamin C were determined.The result showed that different samples had must of antioxidation abilities,and the the polysaccharides of Tissue cultivation of Dendrobium Candidum had favourable scavenging action for hydroxyl free radical, superoxide anion free radical and DPPH.When the adding quantity of Polysaccharides of Tissue cultivation of Dendrobium Candidum was 60μg,its scavenging rate to hydroxyl free radical reached 91.4% and its scavenging rate to superoxide anion free radical reached 47.08%;when the adding quantity of Polysaccharides of Tissue cultivation of Dendrobium Candidum was 700μg,,its scavenging rate to DPPH reached 51.91%.
Keywords : Tissue cultivation of Dendrobium Candidum; Polysaccharides; Extraction; Antioxidation

II

目 录
目 录
1 前言 1
1.1 铁皮石斛简介 1
1.2 铁皮石斛多糖简介 1
1.3 铁皮石斛国内外研究现状 2
1.4 试验目的和意义 3
1.4.1 试验目的 3
1.4.2 试验意义 4
2 材料与设备 5
2.1 试验原料 5
2.2 试剂与设备 5
2.2.1 试验试剂 5
2.2.2 试验仪器设备 5
3 内容和方法 6
3.1 组培铁皮石斛多糖的提取 6
3.1.1组培铁皮石斛多糖提取工艺流程 6
3.1.2 操作要点 6
3.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定 6
3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 6
3.2.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定 6
3.3 FRAP法测定组培铁皮石斛的总抗氧化能力 [10] 7
3.3.1 硫酸亚铁标准曲线的绘制 7
3.3.2 组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定 7
3.4 组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力 8
3.4.1 不同物质清除羟基自由基能力的原理 8
3.4.2 组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力 8
3.5 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力 8
3.5.1 不同物质抑制超氧阴离子自由基能力的原理[13] 8
3.5.2 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力 9
3.6 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力 9
3.6.1 DPPH标准曲线的绘制[16] 9
3.6.2 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力 10
4 结果与分析 11
4.1 组培铁皮石斛多糖的提取 11
4.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定 11
4.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 11
4.2.2 铁皮石斛多糖含量的测定 11
4.3 FRAP法测定组培铁皮石斛中多糖类物质的总抗氧化能力 11
4.3.1 硫酸亚铁标准曲线的绘制 11
4.3.2组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定 12
4.4组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力 13
4.5 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子能力 13
4.6 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力 14
4.6.1 DPPH标准曲线的绘制 14
4.6.2 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力 15
5 结论与讨论 17
5.1 结论 17
5.2 讨论 17
指导老师简介 20
致 谢 21

IV

1 前言
1 前言
1.1 铁皮石斛简介
铁皮石斛（D.candidum Wall.ex Lindl.）是兰科石斛属多年生附生草本植物,主要分布于西南和江南各省[1]。 生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐寒。一般均能耐－5℃的低温，是《中华人民共和国药典》中收载的5种石斛属植物之一。铁皮石斛的药用部分是新鲜或干燥茎,有益胃生津、滋阴清热、免疫调节、延缓衰老等功效;用于阴伤津亏,口干烦渴,食少干呕,病后虚热,目暗不明。铁皮石斛的种子极小、无胚乳,在自然条件下,需与某些真菌共生才能萌发,故很难生产足够的实生苗用于栽培;而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低,加上人为的过度采挖和破坏生境,其资源已濒临灭绝[2],是被国家列为重点保护的药用植物之一。对铁皮石斛大力开发栽培，其社会效益、经济、生态效益均十分显著。
由于生长环境的改变以及人们对它药用价值的认识加深，野生铁皮石斛数量大减，组织培养的石斛成了石斛来源的重要组成部分。目前通过组织培养再生铁皮石斛植株的途径至少有以下4种：种子(胚)→原球茎→小植株；种子→原球茎→愈伤组织→丛芽→生根苗；种子→原球茎→人工种子→幼苗；茎尖→愈伤组织→丛芽→生根苗[3]。新鲜的铁皮石斛苗呈圆柱形或扁圆柱形,长约300mm,直径4～12mm,表面黄绿色,光滑或有纵纹,节明显,色较深,节上有膜质叶鞘。肉质,多汗,易折断。气微,味微苦而回甜,嚼之有黏性。铁皮石斛现在主要存在的问题是在铁皮石斛的分产栽培、开发利用等系统性、综合性研究上一直较为薄弱，大多仍是铁皮石斛初层次探究的重复性试验。当前在对这一珍稀草本植物资源采取有力的保护措施之外，急需对铁皮石斛优良品种的选育、栽培和开发利用等综合技术开展深入的研究，以充分利用铁皮石斛所具有的各成分的药用价值发挥更大的经济社会效益。

1.2 铁皮石斛多糖简介
铁皮石斛多糖系从铁皮石斛植株里提取出的多糖类物质，在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖等方面有很好的作用,在治疗胃肠道疾病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病有很好的疗效。铁皮石斛含有石斛多糖、石斛碱、蛋白质、17种氨基酸及7种无机元素等成分，经研究发现,多糖是石斛属植物的主要活性成分[4]。
在免疫调节、抗肿瘤作用方面，黄民权等[5]研究认为，铁皮石斛多糖能显著提升小白鼠外周白细胞数和促进淋巴细胞产生移动抑制因子，强有力地消除实验条件下环磷酰胺的加入所引起的外周白细胞的剧烈下降，解除其破坏性的副作用。张红玉等[6]试验结果显示铁皮石斛多糖对S180 实体瘤均有一定的抑制作用,其抑瘤率为9.7%～26.8% 。铁皮石斛多糖对S180 肉瘤小鼠T 淋巴细胞转化功能、NK活性、巨噬细胞吞噬功能及溶血素值均有明显提高作用，表明铁皮石斛多糖具有增强免疫功能的作用。在消化系统作用方面，传统医学认为，铁皮石斛具有益胃生津作用，现代药理研究也证明,铁皮石斛具有促进消化液分泌、促进胃排空和利肝胆的作用。铁皮石斛中所含的石斛碱对人的胃酸分泌有明显的促进作用，同时能使血中胃泌素浓度升高，其机制可能是直接刺激G细胞，引起胃泌素释放增加，使血清胃泌素浓度增高，胃泌素刺激壁细胞,使胃酸分泌增加[6]。在抗氧化、抗衰老作用方面，铁皮石斛含有较高活性的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)，具有较强的抗氧化能力。而且铁皮石斛多糖在碱性条件下对邻苯三酚产生的超氧阴离子自由基、Fenton体系产生的羟基自由基的清除作用和对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系的抑制作用均有显著的效果，表明铁皮石斛多糖具有较好的抗氧化活性。这种优良的天然抗氧化活性剂，其多糖含量、药效均比一般石斛好得多，也越来越多的受到了人们重视和关注。

1.3 铁皮石斛国内外研究现状
铁皮石斛为我国传统中药材,其药用价值为人们所共识，经研究发现多糖是石斛属植物的主要活性成分。随着我国经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，人们对健康和精神生活的需求和品位也日益提高，越来越多的人们认识到要用本身健康的东西来健康自己，铁皮石斛是一味功效显著的珍稀药材，具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症、润肺清咽等药用价值和保健作用，在国际国内应用十分广泛。随着功能开发和应用技术的不断发展，需求量在不断上升，目前是国内近百种药品和保健品的必需原料，全国涉及用到石斛类的制药厂和保健品加工企业有100多家。铁皮石斛主要的消费市场在我国的浙江和上海一带，另外就是港澳和东南亚地区，北京、广州、成都等地近几年市场发展较快，从我国石斛联盟发布的市场信息来看，铁皮石斛的市场和销售都在快速发展。从相关信息来看，目前世界中草药市场销售额为160亿美元，而且每年正以20~30％的速度增长，而我国的中草药产业占整个医药市场的40％左右，近五年来以年平均20％的高速度递增，铁皮石斛所占中草药产业比例越来越高。
铁皮石斛成品目前主要加工成以下三种：（1）铁皮枫斗。通过改进传统的做法，使之从外观、质量等更符合现代消费者的习惯。（2）研磨成粉末，做成胶囊，以盒装保健食品的方式销售。这个过程并不涉及到药品加工，而申请食品保健还是很容易的。中科院植物所都有这样的技术，且很成熟，只要买批号后委托加工就可以做出成品。这个保健品服用后效果表现为：睡眠安稳绵长，无夜梦。白天精神饱满，无疲态。胃口变好，无便秘。情绪安定，不易急躁和动怒。（3）购买已有技术，做成中成药。小规模临床试验证明，在化疗及治疗心血管疾病方面，铁皮石斛中成药辅助疗效十分显著。以片剂口服方式，可部分替代扩张血管的西药烟酸注射液。
铁皮石斛是目前人工栽培最主要的石斛属物种，种内间存在显著差异，研究发现来自不同产地的铁皮石斛，其总多糖、水溶性多糖、生物碱、纤维素含量等均存在显著差异，同一产地的也存在株间的变异[7]。在铁皮石斛的发展中，品种的选育栽培、质量的进一步明确，药用成分的开发研究及推广使用等是目前面临的一系列难点。

1.4 试验目的和意义
1.4.1 试验目的
铁皮石斛的传统功效是滋阴清热、益胃生津、润肺止咳,现代药理研究表明其药理作用与传统功效有一定相关性,但多糖类成分是否是这些传统功效的活性成分值得进一步确证[5]。石斛多糖的提取分离工艺已较为成熟,但石斛的品种繁多,应开展对其他种的石斛多糖结构的提取分离研究。组培铁皮石斛的生长周期短， 以成熟铁皮石斛驯化苗为例：在云南德宏、版纳、文山、红河等地，无霜期长，常温偏高，雨量充沛，比较适合铁皮石斛生长，一般每年的3-10月份进行大棚种植，次年春节前后会有一定的收成，第三年底接近丰产，生长周期在16-24个月。仿野生种植周期比大棚种植稍长，产量更低。而在浙江等地，生长周期还将延长12个月左右。作为组培铁皮石斛，在中国铁皮石斛协会相关专家、教授指导下，采用现代生物工程技术，在组培铁皮石斛的细胞培养、母苗培养所用的用的培养基配方，培实生苗的练苗方法，仿野生栽培方法，栽培基质，人工大面积栽培方法及种植装置等领域取得重大科研成果，摸索出了一整套科学方法。特别是广东惠农苗木发展有限公司研发的“惠农1号”、“惠农2号”营养液在母苗初期营养、培育、及壮苗嫁接、生根苗分化、种苗栽培等方面取得了革命性的突破，将组培铁皮石斛从母苗到种植种苗培育期缩短为3个月，并且经过“惠农1号”、“惠农2号”培养的种植种苗成活率高、药用价值大，经济效益显著。此外,对组培铁皮石斛的研究应注意化学和药理研究的紧密结合,进一步分离提取一些新的天然活性成分,发现已知化合物新的药理活性和药用价值,探索活性成分的作用机制和构效关系,为组培铁皮石斛及其成分的应用提供进一步和科学依据,扩展其适用范围,并为组培铁皮石斛相关的新药研发奠定基础。本文通过以组培铁皮石斛为材料，以组培铁皮石斛提取出的多糖为主要研究对象，对照组培铁皮石斛苗和维生素c进行总还原能力、清除羟基自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH(1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)能力进行测定。通过此试验拟阐提取出的铁皮石斛多糖的抗氧化功能特性。
1.4.2 试验意义
自由基（free radical）是一类含有未配对电子的基团、分子或原子，主要包括超氧阴离子、羟基自由基等，是人体内的代谢产物，在正常情况下处于动态平衡，且浓度很低。当这一平衡被打破，就会对机体造成损害引发一系列疾病[8]。
铁皮石斛味甘，性微寒，归胃、肾经，独特的药用价值历代为人们所推崇。查学强[9]等进行的霍山石斛和铁皮石斛多糖体外抗氧化性能研究表明，两种石斛多糖在碱性条件下对邻苯三酚产生的超氧阴离子自由基、Fenton体系产生的羟基自由基的清除作用和对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系的抑制作用均有显著地效果，表明两种药用石斛多糖均具有较好的抗氧化活性。本试验尝试性的以组培铁皮石斛为对象，研究组培铁皮石斛多糖、维生素C和组培铁皮石斛苗清除自由基的能力，为组培铁皮石斛多糖抗氧化性的研究提供基础数据，为组培铁皮石斛多糖的综合开发利用奠定理论基础。
通过对从组培铁皮石斛中提取出的多糖进行多糖含量的测定，利用FRAP法测定其总抗氧化能力，并对不同样品清除不同自由基的能力进行试验，拟阐明这些不同样品的抗氧化性以及清除自由基的作用效果，为进一步阐明组培铁皮石斛抗氧化稳定性的机制、开发功能性食品、药品、保健品提供理论依据，促使铁皮石斛能得到更好的开发利用，从而带动我们经济的发展。
21

2 材料与设备
2 材料与设备
2.1 试验原料
组培铁皮石斛：2012年10月由昆明静林生物科技提供；为文山铁皮石斛种源。
组培铁皮石斛多糖：将组培铁皮石斛破碎，采用水回流法提取，干燥后置于冰箱中备用。
2.2 试剂与设备
2.2.1 试验试剂
葡萄糖（C6H12O6）；蒽酮；三吡啶三吖嗪(TPTZ)；维生素C；水杨酸；盐酸；醋酸钠；三氯化铁；硫酸亚铁；双氧水；水杨酸；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；邻苯三酚；硫酸；DPPH；甲醇等。以上试剂均为分析纯。
2.2.2 试验仪器设备
HH-2数显电子恒温水浴锅：国华电器有限公司；DGH-9140A数显电热鼓风干燥箱：上海—恒科学仪器有限公司；BT-224S电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-1000紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；电炉；研磨；洗瓶；刀片；冷凝管；分液漏斗；橡皮管；刻度试管；圆底烧瓶；移液器等等。

3 内容与方法
3 内容和方法
3.1 组培铁皮石斛多糖的提取
3.1.1组培铁皮石斛多糖提取工艺流程
浓缩
水回流提取
组培铁皮石斛
破碎 90℃，1h，料水比1:20

干燥
脱色
脱蛋白
脱脂
60℃，0.75Kpa 1h Sevage法 活性炭

组培铁皮石斛多糖
60℃

3.1.2 操作要点
(1) 破碎：组培石斛苗要充分的研磨破碎，有利于多糖的溶解分离。
(2) 提取：破碎的石斛组织于90℃、料水比1:20的条件下回流提取1小时，重复三次，合并提取液。
(3) 脱脂：浓缩液中加入100 mL石油醚水浴回流至沸腾，抽真空过滤。
(4) 脱蛋白：以50 mL多糖浓缩液，15 mL氯仿，5 mL正丁醇为标准比例混合振荡，不加热，离心机离心至离液面交界处无白色混悬物，也就是蛋白质介于提取液与试剂交界处即可，并分别提取。
(5) 干燥：脱色后的多糖液于烘箱中用60℃热风干燥至恒重，保存备用。

3.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定
3.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
精密称取经105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.05g（精确到0.0001g），用温蒸馏水溶解，并定容至1000 mL。此溶液质量浓度为50μg·mL-1。分别取上述葡萄糖溶液0 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL、1.6 mL到25 mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2mL；在冰水浴中加入4 mL的2g/ mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5min，取出后用流动水冷却至室温，以零管为空白，于625nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标建立标准曲线，如图1所示。
3.2.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。
分别取组培铁皮石斛多糖储备液(50μg·mL-1)和组培铁皮石斛苗储备液(50μg·mL-1)1.6mL到25mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2mL；在冰水浴中加入4 mL的2g/ mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5min，取出后用流动水冷却至室温，以葡萄糖样品中零管为空白，于625nm处测定吸光度。由标准曲线求得对应的多糖浓度，以葡萄糖计。

3.3 FRAP法测定组培铁皮石斛的总抗氧化能力 [10]
FRAP ( Ferric Reducing Ability of Plasma)法反映被测样品的总抗氧化能力，能够体现待测样品整体抗氧化水平，该法常被用以表明样品的抗氧化功能特性，故采用FRAP法评估组培铁皮石斛多糖抗氧化活性的能力。其原理是抗氧化活性物质将Fe3+还原为Fe2+ , Fe2+ 与三吡啶三吖嗪(TPTZ)结合生成明显的有色络合物,并在593nm 处有最大光吸收。吸光值越大，表明待测样品有愈强的还原能力，因而具有愈高的抗氧化活性。样品的还原力以达到相同吸光值的硫酸亚铁当量浓度表示，记为FRAP值。
3.3.1 硫酸亚铁标准曲线的绘制
据参照文献[10]，取不同体积5～140μL的1mmol/LFeSO4 溶液，用蒸馏水补足至2mL，再加入配制好的FRAP工作液3mL，混匀后于37℃反应30min，在593nm下测定样品液的吸光度值，确定还原力标准曲线。
FRAP工作液的配制:用40mmol/L盐酸溶液溶解，配成1.6mmol/LTPTZ，配制pH3.6的醋酸盐缓冲液300mmol/L和20mmol/LFeCl3溶液。三者以1:100:1的比例混合配成工作液。
3.3.2 组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定
分别精密移取不同样品质量50～300μg的3种待测样品加入到有刻度试管中，加蒸馏水至2mL，再加入FRAP工作液3mL，混匀后于37℃反应30min，取出后立即在593nm处测定吸光度。以不加样品组为参照，测定样品吸光度值，每个样品平行测3次，取平均值。根据还原力标准曲线，计算相同吸光度值的FeSO4当量浓度，记为FRAP值。

3.4 组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力
3.4.1 不同物质清除羟基自由基能力的原理
根据Fenton反应的方法，建立·OH自由基产生体系模型。H2O2与二价铁离子混合后产生·OH的Fenton反应为: H2O2 + Fe2+ →OH- +·OH + Fe3+。·OH具有很高的反应活性，在反应体系中加入水杨酸，能有效的捕获· OH并产生有色物质，该产物在510 nm处有强吸收。加入具有清除·OH能力的被测物，被测物会与水杨酸竞争·OH,从而使有色产物的生成量减少。采用固定反应时间法，并与无·OH的空白组比较,便能测定被测物·OH的清除能力[11]。
3.4.2 组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力
在刻度试管中加入5mL的蒸馏水,30μL的0.02mol/L的FeSO4,100μL0.01 mol/L水杨酸,最后加入25μL0.02 mol/LH2O2启动反应, 放置37℃水浴保温反应30 min,之后立即在510nm处测定吸光度，作为空白吸光度值。同上，在刻度试管中分别加入不同系列5～60μg的样品后, 再加入25μL0.02 mol/L H2O2启动反应，水浴恒温30 min,之后测定吸光度值作为加样品后吸光度值[12]。
清除率= [(A1 -A0)/A0]×100% ①
式中:A1 为加入待测物后的吸光值;
A0 为空白对照的吸光值。
3.5 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力
3.5.1 不同物质抑制超氧阴离子自由基能力的原理[13]
邻苯三酚自氧化—分光光度法被广泛应用于食品和药品行业的抗氧化剂初步筛选及各种活性物质清除超氧阴离子自由基的抗氧化功能评价。邻苯三酚自氧化过程为链式反应，可产生O2-，其自身氧化产物的含量用分光光度仪检测。在pH值<9.0时，邻苯三酚自氧化速率与生成的O2-的浓度呈正相关，故可通过紫外可见光分光光度仪来定量测定抗氧化剂在此体系中对O2-的抑制作用，间接评价抗氧化剂的抗氧化能力。
在碱性条件下，邻苯三酚迅速氧化释放出超氧阴离子，生成带色的中间产物，反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色。加入不同极性酚类物质抑制其自氧化速度，在325nm[13]处测定溶液的吸光度，邻苯三酚自氧化速度随其浓度的升高而增加，吸光度随之增加，使吸光度值与反应时间呈良好的线性关系。多酚物质加入邻苯三酚自氧化体系后，催化超氧阴离子生成过氧化氢，使有色中间产物的生成受阻，导致吸光度值下降，邻苯三酚自氧化速率降低，可作为测定组培铁皮石斛中多糖类物质抗氧化性的理论依据。
3.5.2 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力
以改良邻苯三酚自氧化的速率来表示抑制超氧阴离子自由基的能力[14]
加入样品前：将pH8.2Tris-HCl缓冲液和50 mmol.L-1邻苯三酚在25℃的恒温水浴锅中保温，取5mL pH8.2Tris-HCl缓冲液，加30μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325nm下立即测定。以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5 min测一次吸光值，计算出平均值A0。
加入样品后：取5mL pH8.2Tris-HCl缓冲液，加待测样品5～60μg、30μL 50mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5 min测一次吸光值，计算出平均值A1。
抑制率= [ (A0 - A1)/A0 ] ×100% ②
式中：A1 为加入待测物后的吸光值;
A0 为空白对照的吸光值。

3.6 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，是以氮为中心的自由基，其醇溶液呈紫色，具有单一电子，故能接受一个电子或氢离子，在波长为515nm下具有最大吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最大光吸收波长处的吸光值下降，且下降程度呈线性关系，从而以评价试验样品的抗氧化能力。此抗氧化能力用清除率来表示，清除率越大,氧化性越强。
在DPPH醇溶液中加入多糖后，多糖可以与DPPH结合或发生替代，使DPPH数量减少，溶液颜色变浅，表现为：其在515nm波长处的吸光度不断减小，40min后达到稳定。因此，可以通过在515nm波长处检测多糖对DPPH自由基的清除效果，计算其抗氧化能力[15]。
3.6.1 DPPH标准曲线的绘制[16]
精密称取DPPH0.0202g，加甲醇溶解，定容至50mL，作为储备液。精密移取上述储备液10mL至100mL容量瓶中，定容得40.4mg·L－1的储备液，备用。分别精密移取DPPH储备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL于10mL刻度试管中，用甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇溶剂作参比，在515nm处测定各溶液的吸光度。以DPPH的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
3.6.2 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力
测定方法见参考文献[16]，稍作修改。分别在1.0mLDPPH储备液中加入不同质量(200～800μg)样品待测物，用甲醇稀释至总体积为3.00mL，混匀放置40min后，用1cm比色皿于515nm处测定吸光度，根据DPPH标准曲线回归方程计算DPPH质量浓度，按下列公式计算DPPH清除率(Y)。
Y=(1-Ct/C0)×100% ③
式中:C0 为反应体系中DPPH的起始质量浓度(mg·L－1 );
Ct 为40min后反应体系中DPPH 的质量浓度(mg·L－1 )。

4 结果与分析
4 结果与分析
4.1 组培铁皮石斛多糖的提取
组培铁皮石斛在捣碎情况下于90℃、料水比1:20、一次1小时条件下浸提，分三次完成，最后得组培铁皮石斛多糖得率为4.25％。

4.2 组培铁皮石斛多糖含量的测定
4.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制
以吸光度（Y）对葡萄糖质量浓度（X）回归，得到回归方程y = 0.0516x - 0.0041,所得葡萄糖标准曲线如下图1所示。

图1　葡萄糖标准曲线

4.2.2 铁皮石斛多糖含量的测定
将组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗用蒽酮-硫酸法测定多糖含量，组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗中多糖的纯度分别是：73.15％,10.51％。,由此可见,组培铁皮石斛多糖中可被检测到的多糖明显超过组培铁皮石斛苗。

4.3 FRAP法测定组培铁皮石斛中多糖类物质的总抗氧化能力
4.3.1 硫酸亚铁标准曲线的绘制
以硫酸亚铁系列不同浓度吸光值(Y)对硫酸亚铁质量浓度(X)回归，得到回归方程y = 0.0005 x - 0.0002,所得硫酸亚铁标准曲线如下图2所示。

图2 还原力标准曲线

4.3.2组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定
通过FRAP法，3种不同样品总抗氧化的能力见图3所示。

图3 FRAP法测定不同样品的还原力

由图3可知，当样品加入量在50～300μg范围时，随着组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及维生素C加入量的增加,其总抗氧化的能力也随之增强。组培铁皮石斛苗的抗氧化能力最弱，组培石斛多糖抗氧化能力相对较强,而维生素C的总抗氧化能力优于组培铁皮石斛苗。总体说来组培铁皮石斛多糖的总抗氧化能力明显比组培铁皮石斛苗强得多。

4.4组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力
依据Fenton反应体系建立的清除羟基自由基能力，其结果如图4所示。

图4 不同样品对·OH清除作用
由图4可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力高于其余样品，维生素c对羟基自由基清除能力相对较低，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力最低。由此可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力较高，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力相对较弱。

4.5 组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子能力
不同样品抑制超氧阴离子能力如图5 所示。

图5 不同样品对O2-抑制作用

由图5可知,三种不同物质都具有一定的抑制超氧阴离子自由基的能力。随着样品含量的增加,样品抑制超氧阴离子自由基的能力不断增强。组培铁皮石斛苗抑制超氧阴离子自由基的能力相对较弱，当样品加量为10μg时，对超氧阴离子自由基的抑制率仅为3.48%，加样量增大到60μg时，抑制率也仅为23.47%；组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力相对较强，即当样品质量均增加到60μg时，组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力达到了47.08%，维生素C次之，抑制超氧阴离子自由基能力达到了44.19%。

4.6 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力
4.6.1 DPPH标准曲线的绘制
配制DPPH标准溶液系列，绘制出DPPH标准曲线见图6。标准曲线线性回归方程为y = 0.0208x + 0.0009，在DPPH质量浓度为2～16mg·L－1线性关系良好。

图6 DPPH标准曲线

4.6.2 组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力
根据标准曲线，得出不同样品清除DPPH自由基能力见图7所示。

图7 不同样品对DPPH的清除作用

由图7可知，随着反应体系中加入组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及维生素C的质量愈大,其清除DPPH自由基的能力愈强。对不同样品物质所表现出来的清除DPPH自由基的能力有所不同。实验结果表明，组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力相对较强，当石斛多糖质量为700ug时，组培铁皮石斛多糖清除率达到51.91%，而其他两个样品对DPPH的清除率效果均低于组培铁皮石斛多糖。

5 结论与讨论
5 结论与讨论
5.1 结论
(1) 通过研究表明，将组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗用蒽酮-硫酸法测定多糖含量，石斛多糖和石斛含糖量分别是：73.15％,10.51％，组培铁皮石斛多糖中可被检测到的多糖含量明显超过了等质量的组培铁皮石斛苗；组培铁皮石斛苗、组培铁皮石斛多糖及维生素C的总抗氧化的能力均随加入量愈多，抗氧化能力愈强，其中组培铁皮石斛苗其抗氧化能力较弱，组培铁皮石斛多糖其抗氧化能力相对较强，维生素C抗氧化能力介于多糖和原料之间。由此可见，我们将组培铁皮石斛中的多糖进行提取纯化，进行应用于食品加工中，具有重要意义。
(2) 三种不同样品的浓度愈大，清除羟基自由基的作用愈强，其中组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力较高，当加入样品质量达到60μg时，清除率达到91.40%，而维生素C清除能力相对较弱，组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力相对最差。
(3) 随着样品质量的增加，抑制超氧阴离子自由基的能力增强，组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力较强，当其质量达到10μg以上时，抑制率达到22.12%以上，组培铁皮石斛苗抑制超氧阴离子自由基的能力也相对较弱，当其质量达到10μg时，其对超氧阴离子自由基抑制率仅为3. 48%，维生素C抑制超氧阴离子自由基的能力相对好些，达到6.08%。
(4) 采用DPPH法对组培铁皮石斛苗、组培铁皮石斛多糖及维生素C进行了体外抗氧化活性研究，发现组培铁皮石斛苗、组培铁皮石斛多糖及维生素C在低浓度和高浓度时，均有一定的清除DPPH自由基的能力，当质量增大到400μg 时组培铁皮石斛苗清除率高过维生素C，当质量增大到700μg 时维生素C清除率高过组培铁皮石斛苗达45.27％；铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力一直高于另外两个样品，当质量增大到700μg时清除率达到51.91%。

5.2 讨论
(1) 在组培铁皮石斛多糖的提取过程中，恒温萃取和真空浓缩都涉及到温度的控制，在实验过程中应严格控制所需温度。通过查阅资料得知铁皮石斛多糖类物质不耐高温，高温会使多糖类物质氧化分解，从而影响试验数据结果，所以在多糖类物质提取过程中对温度的控制要格外认真、仔细。
(2) 制作硫酸亚铁标准曲线和样品总还原能力测定时使用到FRAP工作液，该工作液要现用现配，否则工作液将产生絮状物，从而影响试验效果或数据。
(3) 在测定组培铁皮石斛苗、维生素C及组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子时要准确把握试验过程中试剂加入的时间，保证是同一个人操作这个过程，减小因为个人操作不同带来时间把握上的差异。因为此实验过程中要求配好溶液立即测定，每个样品测定三次吸光值，且每隔30秒测一次。因此，在操作时不能等所有样品加好后统一测定，这样得出的试验数据就没有任何意义。
(4) 通过测定三种不同样品清除自由基能力的结果表明：不同样品物质在清除自由基时，部分低浓度清除自由基能力相对较低的样品物质，随着浓度的依次增大，其对自由基的清除率会高于原本低浓度时相对较高的样品物质。这可能是和不同样品物质在不同浓度下对自由基清除能力强弱有关。
(5) 总体说来，本试验通过对组培铁皮石斛的多糖含量进行测定以及其抗氧化性能进行尝试性的研究，对比成熟铁皮石斛其多糖含量达到4.25％，纯度达73.15％，均接近成熟铁皮石斛；在抗氧化性能方面，组培铁皮石斛多糖有良好的抗氧化作用，均优于对照品组培铁皮石斛苗和维生素C。而且组培铁皮石斛的生长周期比成熟铁皮石斛短， 成熟铁皮石斛生长周期平均在16-24个月；作为组培铁皮石斛，目前在中国铁皮石斛协会相关专家、教授指导下，采用现代生物工程技术，在组培铁皮石斛的细胞培养、母苗培养所用的用的培养基配方，培实生苗的练苗方法，仿野生栽培方法，栽培基质，人工大