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肿瘤免疫治疗临床应用及进展 -肿瘤生物治疗学基础与临床教学目的与要求熟悉肿瘤免疫治疗的策略和方法熟悉肿瘤免疫治疗的策略和方法认识免疫治疗在肿瘤综合治疗中的认识免疫治疗在肿瘤综合治疗中的地位和作用地位和作用了解肿瘤免疫治疗的最新进展了解肿瘤免疫治疗的最新进展一、肿瘤的免疫治疗 基本原理基本原理：提高肿瘤抗原免疫原性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，提高肿瘤对抗瘤免疫效应的敏感性，在体内外诱生肿瘤特异性效应细胞和分子等。抗肿瘤免疫治疗包括主动免疫治疗、被动免疫治疗。1 1、干扰素、干扰素1）I型干扰素：由单核巨噬细胞、病毒诱导的成纤维细胞、转化的B细胞产生 种类：IFN-、IFN-、IFN-、IFN-等 作用：抑制肿瘤细胞周期、诱导细胞凋亡 调节免疫反应 感染肿瘤血管生成 其它作用：抗病毒2）II型干扰素：由活化的T细胞、原始的Th0细胞和NK细胞产生 种类：IFN-作用:激活巨噬细胞、NK细胞等直接杀伤癌细胞 延长细胞周期、抑制肿瘤细胞的生长和增殖 促进MHC-I、II类分子和抗原递呈细胞尚共刺激分子的表达 在干扰素的调节下，IFN-可诱导Th0向Th1分化，抑制向Th2分化，增强细胞免疫和CTL的杀伤活性临床药物：基因工程产品，已国产化。干扰灵、赛若金、因特芬、派罗欣。（一）细胞因子治疗适应症适应症：干扰素主要用于治疗晚期毛细胞白血病、肾癌、黑色素瘤、kaposi肉瘤、慢性粒细胞性白血病和中低度恶性非霍奇金淋巴瘤，其他曾用于骨肉瘤、乳腺癌、多发性骨髓瘤、头颈部癌和膀胱癌等。对慢性乙、丙型肝炎也有效。用法用法：第1周300万单位，皮下注射，每周23次，第2周每次加到500600万单位，第3周加到9001000万单位连续6周，共8周为1疗程。干扰素亦可局部注射（瘤周浸润）、腔内注射（癌性胸腹腔积液）或膀胱内灌注。毒副作用毒副作用：高剂量干扰素具有一般生物制剂的反应即发热、流感样症状，肌肉酸痛等，其次是轻度骨髓抑制。一般对肝肾功能无影响，少数有转氨酶、血肌酐升高。2、白细胞介素、白细胞介素-2（IL-2)来源：主要由激活的T淋巴细胞分泌和表达，此外NK、转化的B细胞和LAK细胞也可产生 作用：促进T细胞增殖及相应的细胞因子分泌 刺激NK生长并增强其杀细胞活性 诱导LAK、NK、TIL扩增及细胞因子的分泌 促进B细胞分化、增殖和产生抗体 参与机体的炎症反应、抗肿瘤免疫反应和移植排斥反应临床药物：基因工程IL-2欣吉尔、德路生、远策欣。适应症适应症：用于肾细胞癌、黑色素瘤、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、直肠癌、淋巴瘤、肺癌等恶性肿瘤的治疗。用于癌性胸腹水的控制。用于手术后、放疗及化疗后的肿瘤治疗，可增强机体免疫功能。也用于自身免疫性疾病和病毒性、细菌性疾病的治疗，如乙肝、结核病。用法用法：1）胸腹腔注射 100-200万IU/次，每周1-2次，2-4周为一疗程。2）局部注射 根据癌灶大小决定剂量，每次每个病灶不少于610万IU，隔日1次，4周为一疗程。3）皮下注射 60-100万IU/m3，每日1次，每周5次，4周为一疗程。4）静脉滴注 40-80万IUIU/m3，每日1次，缓慢滴注，每周5次，4周为一疗程。毒副作用毒副作用：治疗中常见副反应为发热、寒战、乏力、恶心、轻度食欲下降等。其他少见的副反应包括局部反应、皮疹、血压下降、水潴留、转氨酶升高等。这些副反应多为轻度、易耐受，停药后可自行缓解。必要时可给与消炎痛或给予升压等措施对症处理。3、IL-12 主要是由抗原呈递细胞（如单核巨噬细胞、主要是由抗原呈递细胞（如单核巨噬细胞、树突细胞及树突细胞及B淋巴细胞产生）淋巴细胞产生）作用：作用：诱导诱导Th0分化为分化为Th1，增强细胞免疫应，增强细胞免疫应答答 促进促进NK、T细胞增殖，诱导细胞增殖，诱导LAK、TIL产产生，生，并增强上述细胞的杀伤功能并增强上述细胞的杀伤功能 诱导诱导Th1、NK分泌分泌IFN-促进巨噬细胞分泌一氧化氮，杀伤肿瘤促进巨噬细胞分泌一氧化氮，杀伤肿瘤细胞细胞 抑制肿瘤血管的生成抑制肿瘤血管的生成 增强肿瘤细胞表达增强肿瘤细胞表达MHC-I II类分子，提高类分子，提高肿肿 瘤细胞对免疫效应细胞的易感性瘤细胞对免疫效应细胞的易感性 增加抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈功能增加抗原递呈细胞对肿瘤抗原的递呈功能动物试验动物试验：应用基因工程技术，将IL-12基因导入肿瘤细胞、树突细胞、成纤维细胞等，制成肿瘤疫苗，使IL-12在局部分泌，诱发机体的抗肿瘤免疫。临床试验临床试验：重组人(rHu)IL-12治疗慢性乙型肝炎，效应与剂量相关，但较大剂量较易有不良反应，IL-12能恢复由实体瘤转移患者PBMC获得的NK细胞活性，IL12还能增强毛细胞白血病患者NK细胞活性，IL-12抗肿瘤作用4、IL-4主要由活化的T淋巴细胞（特别是Th2细胞）产生。作用作用：促进休止期的B细胞活化，促进B细胞分泌IgE，增加B细胞的抗原递呈功能，促进体液免疫应答。维持胸腺细胞和活化T细胞的生长，诱导Th2产生，抑 制Th1分泌细胞因子。诱导NK细胞增殖。激活巨噬细胞，促进其抗原递呈和杀伤肿瘤细胞的作用。诱导外周血单个核细胞分泌M-CSF和G-CSF，增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤功能和抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）应用应用：主要用于DC细胞的诱导、扩增。5、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子TNF1）TNF-：主要来源于LPS、细菌DNA等抗原分子激活的单核巨噬细胞、其它细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞等产生的。作用：影响免疫反应过程 影响非免疫细胞 促进细胞因子分泌 调控细胞凋亡 全身反应2）TNF-：主要由Th1、CD8T细胞和早期的B细胞产生作用作用：是炎症过程的重要组成成分6、集落刺激因子、集落刺激因子 是一种低分子量糖蛋白，能够在体内外选择性刺激造血干细胞增生、分化成某一谱系的细胞分类：G-CSF,M-CSF,GM-CSF,IL-3,EPO,SCF7、胸腺素、胸腺素 分为两族 作用：1）具有免疫增强作用，可促进T细 胞、NK、LAK等细胞的增殖及杀伤 活性 2）参与细胞骨架的形成，通过对 肌动蛋白的调节，参与某些肿瘤的 转移（二）肿瘤的主动免疫治疗 应用肿瘤抗原或模拟肿瘤抗原的疫苗刺激机体免疫系统，激发或增强机体的抗肿瘤特异性免疫应答，阻止肿瘤生长、扩散和复发。肿瘤疫苗 肿瘤疫苗与传统疫苗在概念上不同，它主要不是用于肿瘤的预防，而是通过瘤苗的接种来刺激机体对肿瘤的免疫应答来治疗肿瘤。该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体产生免疫反应。对手术后清除微小转移瘤灶和隐匿瘤、预防肿瘤转移和复发有较好的效果。1、肿瘤细胞疫苗 即通过自体肿瘤细胞粗提取物，经物理化学或生即通过自体肿瘤细胞粗提取物，经物理化学或生物手段处理后抑制其生长能力，保持其免疫原性，物手段处理后抑制其生长能力，保持其免疫原性，需加入佐剂如卡介苗等以增强免疫原性。需加入佐剂如卡介苗等以增强免疫原性。2、肿瘤基因工程疫苗 肿瘤基因工程疫苗通过基因重组技术，将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗。2 2、肿瘤基因工程疫苗、肿瘤基因工程疫苗1)、提高机体抗肿瘤能力 将外源基因导入免疫细胞，其表达产物作用于免疫细胞，促进免疫细胞生长、分化，从而提高机体的抗肿瘤能力。目前研究较多的是细胞因子基因的转导，如IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-15、IL-18、IFN-以及GM-CSF等。实验显示，在各种细胞因子中，以GMCSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗效果最好，这与其诱导DC成熟有关。2)、增强肿瘤免疫原性 通过表达肿瘤所缺乏的某些分子，以增强其免疫原性。如将B7基因导入具有肿瘤抗原的肿瘤细胞，不仅能恢复肿瘤特异性免疫反应，也可增强IL-2的抗瘤活性。一些肿瘤相关抗原（TAA）基因的转导研究，显示也可以增强其免疫原性，如CEA、AFP、gp100、MART-1。3)、基因产物直接杀伤瘤细胞如TNF基因导入肿瘤细胞可使局部持续分泌TNF、从而直接杀伤肿瘤细胞。3、肽疫苗8-10个氨基酸的多肽是个氨基酸的多肽是T细胞识别的基础细胞识别的基础肽疫苗主要包括以下二种：1）、癌基因、抑癌基因突变肽疫苗 目前已合成的p21-K-Ras-125突变肽、EGFRvIII突变肽和Her2/neu肽等。2）、病毒相关疫苗如EB病毒与鼻咽癌、Burkitt淋巴瘤，HBV与肝癌，人类T细胞白血病病毒与成人T细胞白血病。ONCOPHAGE(VITESPEN)通过加工、纯化自体肿瘤细胞的gp96等热休克蛋白HSP，获得大量肿瘤抗原。一项III 期临床研究中728 肾癌术后随机分为观察组和治疗组结果：复发率 观察组 治疗组 P值 全部 27.3%25.0%0.384 I+II期 27.0%15.2%0.056 III+IV 27.5%32.0%0.686 中危患者*30.9%16.3%0.004 中危患者*:I/II期低分化/III期高分化 俄罗斯2008-4-9批准Oncophage用于中危肾癌的辅助治疗。Lancet.2008(9633):1454、核酸疫苗 核酸疫苗是由能引起保护性免疫反应的抗原基因片段及其载体构建而成。包括DNA疫苗和RNA疫苗。4、核酸疫苗5、抗独特型抗体疫苗肿瘤抗原可诱导抗体(Ab1)产生，该抗体可变区的独特型决定簇具有免疫源性，可诱导抗体Ab2产生，称为抗独特性抗体。也是一种抗抗体。在这些Ab2中，有的可模拟原来的抗原结构诱导抗原的特异性免疫反应，可作为肿瘤疫苗应用。这种种疫疫苗苗的的特特点点是是，它它既既不不是是天天然然抗抗原原的的本本身身，也也不不是是人人工工合合成成的的抗抗原原自自身身，而而是是抗抗原原本本身身的的“摸摸拟物物”，当当用用这种种疫疫苗苗接接种种时，机机体体虽然然没没有有直直接接接接触触抗抗原原，却却能能产生生对相相应抗抗原的免疫原的免疫应答答具有抗原放大效具有抗原放大效应已进入已进入、期临床期临床的的抗独特型抗体抗独特型抗体：卵巢癌相关抗原CA125的独特型疫苗：AcA125黑色素瘤的独特性疫苗：BEC2、TriGem等淋巴瘤的独特性疫苗：Id-KLH乳腺癌的独特性疫苗：1E10结直肠癌的独特性疫苗：105AD76、树突状细胞（DC）疫苗 肿瘤抗原属于内源性抗原，机体主要依靠CTL免疫应答杀伤肿瘤细胞。但肿瘤细胞表面的MHC-抗原肽段复合物表达水平低，需要经体内抗原提呈细胞加工、处理，提供诱导T细胞活化的第二信号，才能激发肿瘤特异性CTL的产生。由于DC在诱导体液免疫应答和细胞免疫应答中的重要功能，目前认为，DC在启动抗肿瘤免疫的抗原呈递中发挥重要作用。DENDRITIC CELLS CONNECT INNATE IMMUNITY AND ADAPTIVE IMMUNITY人DC至少有三条来自于不同前体细胞的发育途径：1）CD34+细胞分化为DC2）外周血单核细胞分化为DC3）淋巴样DC前体细胞分化途径临床应用治疗恶性淋巴瘤肿瘤抗原可以基因、多肽、蛋白、甚至完整细胞的形式负荷给DC，因此DC疫苗的制备明显比基因修饰的肿瘤细胞疫苗容易，因而促进了DC疫苗进入临床试验。1996美国斯坦福大学的Hsu等首先采用抗独特型抗体负荷的DC疫苗治疗了4例B细胞型淋巴瘤，3例获部分缓解。抗原冲击DC治疗乳腺癌（I/II期临床）病人：病人：高表达高表达HER2的转移性乳腺癌病人的转移性乳腺癌病人16例例方法：方法：HER500冲击的自体冲击的自体APC 2108 to 5109，二周一次，共三次。二周一次，共三次。副作用：主要为寒战和发热，没有副作用：主要为寒战和发热，没有3-43-4级的毒副反应级的毒副反应结果：结果：12个可评价的病人，个可评价的病人，1例例PR 结论：结论：HER500冲击的自体冲击的自体DC使用安全，有一定使用安全，有一定疗效，但效率仍不够高。疗效，但效率仍不够高。J.W.Kylstra,et al.ASCO2003治疗转移性肾癌（I/II期临床）病人：病人：转移性肾癌转移性肾癌 15例例方法：方法：肿瘤细胞溶解物冲击的肿瘤细胞溶解物冲击的DC 3.95106 淋淋巴结内注射巴结内注射副作用：副作用：无明显的毒副作用无明显的毒副作用结果：结果：7例进展，例进展，7例稳定，例稳定，1例部分退缩例部分退缩(14.4106细胞细胞)结论：结论：肿瘤细胞溶解物冲击的肿瘤细胞溶解物冲击的DC，即使在有，即使在有大负荷肿瘤时也有效，在大剂量使用时更有大负荷肿瘤时也有效，在大剂量使用时更有效，无毒副作用。效，无毒副作用。Marten A,et al.Cancer Immunol Immunother.2002 PROVENGE(SIPULEUCEL-T)Provenge是是PA2024(GM-CSF和和PAP的融合蛋白的融合蛋白)与自身树突状细胞与自身树突状细胞孵孵育后育后获获得的自体得的自体DC细细胞疫苗胞疫苗。III期研究设计期研究设计:127例无症状激素治疗无效的转移性前列腺癌患者例无症状激素治疗无效的转移性前列腺癌患者，以以2:1比例比例接受接受sipuleucel-T(2周周1次，连续次，连续3次次)或安慰剂治疗，或安慰剂治疗，3月后曲线分月后曲线分离。离。J Clin Oncol.2006:3089DC VAX-BRAIN患者DC细胞经自体肿瘤细胞刺激后获得。胶质瘤手术联合放化疗的MS为14.6个月，TTP为6.9个月。N Engl J Med,2005:987I期和I/II期研究中发现胶质瘤经DCVax-Brain治疗后（皮下注射）后，3年存活率为53%，95%的患者MS超过14.6个月，TTP超过6.9个月。http:/ 未被识别，因此肿瘤细胞溶解物负荷的DC疫苗可使更多的患者接受此种方法治疗。直接携带肿瘤抗原的DC作用更为直接，可以活化静息的T细胞，诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。（三）肿瘤的被动免疫治疗1 1、单克隆抗体靶向治疗、单克隆抗体靶向治疗 又称之为生物导弹技术，通过补体系统和自然杀伤细胞起抗肿瘤作用。嵌合型单抗达到95以上人源化,减少了异种免疫原性。1）抗肿瘤单克隆抗体直接体内应用 很多进入临床治疗试验，包括抗白细胞 分化抗原CD19、CD20、CD22、CD33，表皮生长因子受体（EGFR），MUC1，前列腺特异性抗原（PSA），前列腺特异性膜抗原（PSMA），癌基因cerbB2产物，神经节苷酯GD3、GM2等抗原的单抗。2）抗肿瘤单克隆抗体与抗肿瘤药物、生物毒素、细胞因子或放射性核素偶联：生物毒素，如假单胞菌毒素或蓖麻毒素；放射线同位素，如131I、186Re、177Lu、90Y、212Bi、67Cu、等 单抗作为导向物可增加毒素、放射性同位素等在肿瘤局部 的浓度，增加对肿瘤的杀伤力或诱导肿瘤局部的免疫反应。3）基因工程抗体-毒素（或酶）融合蛋白直接杀瘤 4）抗肿瘤单克隆抗体和抗效应细胞表面分子的抗体组成双特异性抗体，可引导杀瘤效应细胞向肿瘤灶集中 5)胞内抗体在肿瘤细胞内表达，特异性作用于致瘤的癌基因产物或端粒酶 2 2、肿瘤过继性免疫治疗、肿瘤过继性免疫治疗 向肿瘤患者体内输注具有抗瘤活性的免疫细胞，直接杀伤肿瘤细胞或激发机体抗肿瘤免疫效应。回输的效应细胞包括：在体外用肿瘤抗原或淋巴因子激活的淋巴细胞（CIK、TIL等）、导入外援细胞因子基因并表达相应产物的淋巴细胞等。11)LAK细胞 LAK细胞是在1980年由美国国立癌症研究所Rosenberg发现，并在1982年由Grimm等命名的。这是一类由IL-2激活的能够杀伤NK抵抗的新型免疫细胞，是一种强烈的，广谱的，具有杀瘤活性的细胞。随后临床上广泛应用于肿瘤等疾病治疗。但由于LAK细胞活性的维持需要IL-2，而IL-2副作用大，而且在以后的临床总结中发现LAK细胞疗效较低，现已基本不用。2)CD3AK细胞是在LAK细胞基础上，用抗CD3单抗和IL-2联合诱导的杀瘤细胞。由于使用了抗CD3单抗刺激，减少了IL-2的用量，降低LAK治疗的毒副作用，且CD3AK的抗肿瘤活性大大高于LAK细胞。对晚期恶性肿瘤患者输注自体 CD3AK细胞 1个疗程后,实体瘤组治疗有效率为 25.45%,临床获益率为 74.54%;淋巴瘤组有效率为 83.33%,临床获益率为 91.67%。在利用外周血淋巴细胞制备免疫效应细胞的研究中，为增加效应细胞的数量和杀瘤活性，常添加一些激活剂如抗CD3单抗，植物血凝素PHA等，以提高免疫治疗疗效。实验显示PHA预刺激虽能促进IL-2激活的杀伤细胞的增殖，但对杀伤活性并无明显改善，而培养15天以上，经PHA预刺激的P-LAK和P-CD3AK细胞杀伤活性显著提高，且PHA与抗CD3单抗有协同效应。3)TIL细胞（肿瘤浸润的淋巴细胞）肿瘤浸润的淋巴细胞，是从新鲜的肿瘤组织中分离出来，体外经IL-2，抗CD3单抗，TNF等刺激，经20-45天培养，获得的具有一定特异性的抗肿瘤细胞。其局限在于分离困难，体外培养时间过长。我们于1997-1998年选择21例癌性胸腹水患者，其中肺癌4例，乳腺癌5例，肠癌4例，骨癌7例，胰腺癌1例。所有病例均经病理学和细胞学诊断。共抽取33次胸腹水做TIL细胞培养，抽取胸水2502200ml，腹水量12004400ml。21例患者中14例经16次的TIL胸腹腔回输治疗。回输期间隔天皮下注射IL-250万单位。14例患者回输治疗结果显示总有效率为78.57%，其中3例胸腹水消失，并观察1个月无复发，1个月后检查胸腹水无瘤细胞；8例胸腹水有明显减少，并控制1个月以上；3例仅控制12周。4)TAK细胞 TAK是由可溶性肿瘤抗原，抗CD3单抗和IL-2共同诱导的杀瘤细胞。用可溶性肿瘤抗原诱导细胞识别肿瘤，以提高杀瘤亲和性；用抗CD3单抗诱导所有T细胞活化，培养出以CD8+T细胞为主的杀瘤细胞。TAK细胞不仅增加了杀瘤的特异性，且体外增殖快，IL-2用量低。用胃癌可溶性抗原（TSA），联合抗CD3单抗和IL-2共同刺激正常人的外周血单核细胞，培养10天后，经流式细胞仪表型分析，表明其免疫效应细胞以CD8+T细胞为主，其细胞增殖速度，增殖水平与CD3AK和LAK相比明显升高，且对抗原来源的胃癌细胞具有极强的杀伤活性（98.5%），高于CD3AK（82.1%）和LAK（62.05%）。我们于1996-1998年，采用静脉或口服化疗和免疫效应细胞输注为主体的化学免疫疗法，治疗晚期原发性肝癌18例。收治的38例晚期原发性肝癌病人中，18例采用化学免疫疗法（甲组），同期收治的晚期肝癌患者，除对症处理外，单用静脉化疗或肝动脉插管化疗20例，列为对照组（乙组）。总缓解率（总缓解率（CR+PR）：）：甲组22.22%（4/18）乙组0%无1例缓解5)CIK细胞 是将人外周血单个核细胞经体外用各种细胞因子共同刺激培养所获得的免疫细胞。由于同时表达CD3和CD56分子，故又称为NK样T细胞，CIK细胞兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，其抗肿瘤活性远大于LAK和TIL。因此被认为是新一代肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。刺激因子除了抗CD3单抗、IL-2外，还需用IFN-和IL-1等细胞因子。CIK细胞杀伤机制、识别、识别 由于CIK的细胞杀伤作用是非MHC限制性的，故CD4、CD8在其识别肿瘤细胞或病毒感染的细胞过程中并非必不可少。细胞表面粘附分子LFA-1ICAM-1在CIK细胞识别过程中起关键作用。对正常细胞无毒性作用。、杀伤杀伤 细胞对肿瘤细胞或感染细胞的直接杀伤：CIK细胞在受到外源性抗原或敏感靶细胞刺激时会释放具有细胞毒性的胞浆颗粒物到膜外空间，其中细胞可产生最大的颗粒释放量。这些胞浆颗粒物对靶细胞具有直接杀伤作用。炎性细胞因子的杀伤活性：培养的细胞可以分泌多种细胞因子，如、（肿瘤坏死因子）、等，不仅对靶细胞有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤靶细胞。诱导肿瘤细胞凋亡：细胞在培养过程中表达（型跨膜糖蛋白），一方面增强了其对肿瘤细胞引发的凋亡的抵抗性，还可通过对（型跨膜糖蛋白）肿瘤细胞诱导凋亡行使其对肿瘤细胞的慢性杀伤作用，保证抗瘤活性的长期持久。CIK细胞的杀瘤特点 1、增殖速度快CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极其罕见，仅1%5%，在体外经多因子培养2830天，CD3+CD56+细胞迅速增多，较培养前升幅可达1000倍以上。且所占百分比也大幅上升，细胞毒活性亦达峰值。2、杀伤活性高、杀瘤谱广CIK细胞的总杀伤单位（TLU）为LAK细胞的73倍甚至更高，CIK细胞的瘤细胞抑制Log指数为2.53.5，较LAK细胞的瘤细胞抑制指数高2个Log。其抗病毒活性大大增强。因没有T淋巴细胞杀伤时的MHC限制性，故对于多种肿瘤细胞系和新鲜肿瘤组织均表现出强大的杀伤活性。3、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感CIK细胞对化疗药物敏感的亲本细胞和不敏感的转化细胞均具有强大的杀伤活性，两者比较无差别。4、杀瘤活性不受CsA、FK506等免疫抑制剂的影响免疫抑制剂CsA（环孢霉素A）和FK506（普乐可复）不影响靶细胞诱导的CIK细胞脱颗粒，并且CIK细胞对靶细胞的杀伤活性不会因此降低。5、对正常骨髓造血前体细胞毒性很小CIK细胞对正常髓系克隆生成几乎没有影响，对GM-CFU（粒细胞巨噬细胞集落形成单位）仅有不足1级的抑制。6、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡CIK细胞内有抗凋亡基因表达，并检出多种保护基因，如Bcl-2等和survivin的转录水平上调。CIK细胞具备合成FasL的能力，CIK细胞可以对抗体内FasL阳性肿瘤所引发的效应细胞活性下降。CIK制备采集：外周血单个核细胞。分离：PBMNC经淋巴细胞分离液分离、洗涤后悬浮于含10%AB血清的RPMI1640中。培养：第一天培养加入-IFN1000U/ml，24小时后加入IL-21000U/ml，在37，5%CO2孵箱中培养。以后每3天更换培养液补加IL-21000U/ml；培养710天。无菌检测：细菌霉菌培养阴性；热源检测阴性。收获：收集细胞，加入含1%白蛋白的生理盐水洗涤。回输：洗涤后的细胞悬浮于1%白蛋白生理盐水中，将CIK细胞通过输血器经静脉输给患者。疗程：培养的第8-10天开始，分八袋回输，每次间隔1-2天。自回输CIK细胞前一天起,可每日静脉输注IL-2，每日剂量为100万单位直到回输结束。临床应用 体内回输CIK细胞,可以在没有损伤机体免疫系统结构和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞,并可调节和增强机体的免疫功能。特别适应于那些对手术、放疗、化疗已无适应证的晚期肿瘤患者,因而成为治疗肿瘤的重要辅助治疗方法,为预防肿瘤复发、改善生存质量提供了新途径。一般在放疗、化疗后间隔24周,机体免疫力有所恢复时,输入CIK细胞,可提高肿瘤患者的缓解率并在清除微小残留病灶方面发挥重要作用。6)DC-CIK 将外周血来源的CIK细胞和同源DC细胞共培养一段时间后发现,DC和CIK细胞的增殖能力明显增强,共培养14d后CIK细胞的增殖倍数比共培养7d时高出2倍左右。共培养24h后,DC细胞白细胞介素12的分泌量为单独培养时的6.93倍,与DC细胞共培养的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性显著提高。DC-CIK制备流程7)NK细胞自然杀伤细胞(naturalkiller cell,NK)细胞不经致敏可直接杀伤敏感的肿瘤细胞,是宿主抗肿瘤的第一道防线。自然杀伤细胞(黄色)在它们严重破坏机体之前识别并杀死癌细胞(粉红色)或病毒感染的细胞NK细胞受体和配体细胞受体和配体中国肿瘤临床 2013,40卷9090例例食食管管癌癌中中晚晚期期患患者者（TNM TNM III-IVIII-IV期期）接接受受枯枯息息性性手手术术后后，分分为为单单纯纯化化疗疗组组4040例例、化化疗疗联联合合NKNK细细胞胞治治疗疗MCIAMCIA阴阴性性组组（简简称称联联合合MICA-MICA-组组）2525例例及及化化疗疗联联合合NKNK细细胞胞治治疗疗MCIAMCIA阳性组（简称联合阳性组（简称联合MICA+MICA+组）组）2525例。例。中国肿瘤生物治疗杂志 2013,20卷体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本方案体细胞免疫治疗联合肿瘤常规治疗的基本方案恶性肿瘤恶性肿瘤手术治疗手术治疗可手术可手术放化疗敏感（常规放化疗）放化疗敏感（常规放化疗）放化疗间隙联合细胞免疫治疗放化疗间隙联合细胞免疫治疗（卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺（卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌和鼻咽癌等）癌和鼻咽癌等）放化疗不敏感放化疗不敏感（肾癌、前列腺癌、黑色素瘤（肾癌、前列腺癌、黑色素瘤和肝癌等）和肝癌等）放化疗敏感（常规放化疗）放化疗敏感（常规放化疗）放化疗间隙联合细胞免疫治疗放化疗间隙联合细胞免疫治疗（卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺（卵巢癌、乳腺癌、小细胞肺癌和鼻咽癌等）癌和鼻咽癌等）细胞免疫治疗细胞免疫治疗疾病疾病稳定期稳定期细胞免疫治疗细胞免疫治疗联合内分泌或联合内分泌或靶向治疗，细靶向治疗，细胞因子治疗胞因子治疗专科治疗专科治疗（微创介入）（微创介入）不能手术（不能手术（期，期，期）期）复发者复发者细胞免疫治疗细胞免疫治疗疾病疾病稳定期稳定期 化疗不敏感化疗不敏感（原发性肝癌、肾癌、前列腺（原发性肝癌、肾癌、前列腺癌和黑色素瘤等）癌和黑色素瘤等）细胞免疫治疗细胞免疫治疗联合专科治疗联合专科治疗CIK输注不良反应免疫活性细胞回输后患者可出现一过性类流感样症状，如发热（体温37.539.5），轻度头痛、乏力、关节酸痛，持续时间均不超过12h，可自行缓解，所有患者均能很好耐受治疗。3 3、过继性免疫效应细胞治疗的优点、过继性免疫效应细胞治疗的优点 (1)免疫细胞在体外处理，可绕过体内肿瘤免疫免疫细胞在体外处理，可绕过体内肿瘤免疫障碍的种种机制，从而选择性地操作抗肿瘤障碍的种种机制，从而选择性地操作抗肿瘤免疫反应免疫反应:如新鲜分离的肿瘤浸润性淋巴细胞（如新鲜分离的肿瘤浸润性淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）往往缺乏抗）往往缺乏抗肿瘤效应，而在体外一定条件下培养一段时肿瘤效应，而在体外一定条件下培养一段时间后可恢复特异性抗肿瘤作用；在体外培养间后可恢复特异性抗肿瘤作用；在体外培养条件下，肿瘤抗原特异性耐受的免疫细胞可条件下，肿瘤抗原特异性耐受的免疫细胞可被逆转。被逆转。(2)免疫细胞的活化及效应过程往往由一些免疫细胞的活化及效应过程往往由一些细胞因子介导，而目前基因工程可大量细胞因子介导，而目前基因工程可大量克隆不同的细胞因子，也可大量克隆肿克隆不同的细胞因子，也可大量克隆肿瘤抗原或多肽，这使体外活化扩增大量瘤抗原或多肽，这使体外活化扩增大量的抗肿瘤免疫细胞更为可行方便。的抗肿瘤免疫细胞更为可行方便。(3)免疫细胞的体外活化扩增可避免一些制剂免疫细胞的体外活化扩增可避免一些制剂 体内大量应用带来的严重毒副作体内大量应用带来的严重毒副作 用，如用，如:IL2、TNF、IL4、IL7、IL12等具等具有抗肿瘤作用，抗有抗肿瘤作用，抗CD3单克隆抗体单克隆抗体(MabCD3)的体内应用可激活的体内应用可激活T淋巴细胞，但这些制剂由淋巴细胞，但这些制剂由于其复杂的多种作用，在体内大量应用可导于其复杂的多种作用，在体内大量应用可导致严重的甚至致死性副作用，这也是这些因致严重的甚至致死性副作用，这也是这些因子难以被批准临床使用的重要原因，而在体子难以被批准临床使用的重要原因，而在体外操作可避免这些副作用。外操作可避免这些副作用。(4)目前已能在体外大量扩增自体或异基因的抗肿目前已能在体外大量扩增自体或异基因的抗肿 瘤免疫细胞，其数量大于肿瘤疫苗在体内激活的效瘤免疫细胞，其数量大于肿瘤疫苗在体内激活的效 应细胞数，一些体外培养的免疫细胞已进入临床治应细胞数，一些体外培养的免疫细胞已进入临床治 疗试验。疗试验。实验显示肿瘤疫苗在体内应用可增加体内的肿瘤特实验显示肿瘤疫苗在体内应用可增加体内的肿瘤特异性异性CTL数量，但到一定时候，体内的数量，但到一定时候，体内的CTL到达平到达平台期而不再增加，这主要由体内存在的特异性及非台期而不再增加，这主要由体内存在的特异性及非特异性免疫调节网络限制了特异性免疫调节网络限制了CTL克隆的扩增。而在克隆的扩增。而在体外培养可突破此调节网络，大量扩增免疫效应细体外培养可突破此调节网络，大量扩增免疫效应细胞。胞。理想的过继性免疫细胞治疗应具有以下特点理想的过继性免疫细胞治疗应具有以下特点:(1)可大量获得，实验室研究及临床实践显示，可大量获得，实验室研究及临床实践显示，临床治疗量的免疫细胞应在临床治疗量的免疫细胞应在11010以上以上 (2)为肿瘤特异性为肿瘤特异性 (3)抗肿瘤活性强抗肿瘤活性强 (4)体内应用可耐受体内应用可耐受 (5)可聚集在肿瘤灶可聚集在肿瘤灶 (6)可在体内存活可在体内存活 、增殖、增殖 二、免疫治疗的作用 肿瘤免疫治疗即能够直接清除体内的残存肿瘤细肿瘤免疫治疗即能够直接清除体内的残存肿瘤细胞，又能够提高机体的整体免疫功能，还具有将患胞，又能够提高机体的整体免疫功能，还具有将患者个体化的肿瘤抗原信息递呈给体内肿瘤免疫杀伤者个体化的肿瘤抗原信息递呈给体内肿瘤免疫杀伤细胞的独特作用。细胞的独特作用。肿瘤免疫治疗已成为临床上继手术、化疗、放疗肿瘤免疫治疗已成为临床上继手术、化疗、放疗之后的第四种最有效的肿瘤治疗方法。在肿瘤综合之后的第四种最有效的肿瘤治疗方法。在肿瘤综合治疗方案中，免疫治疗成为提高肿瘤治愈率和有效治疗方案中，免疫治疗成为提高肿瘤治愈率和有效率的一个关键措施。率的一个关键措施。三、免疫治疗的临床地位免疫治疗是最有前途的抗肿瘤手段之一免疫治疗是最有前途的抗肿瘤手段之一目前尚未起主导作用目前尚未起主导作用定位于手术、放化疗后清除残留病灶定位于手术、放化疗后清除残留病灶目标是预防复发目标是预防复发关键是抗原在体内有效地被递呈并激关键是抗原在体内有效地被递呈并激 活活T淋巴细胞淋巴细胞四、免疫治疗的原则 虽然目前免疫治疗的方法还不是很有效的，只能配虽然目前免疫治疗的方法还不是很有效的，只能配合其他疗法作为一种合其他疗法作为一种 辅助手段。但从肿瘤免疫的理辅助手段。但从肿瘤免疫的理论看，它涉及的是肿瘤发生发展的内部因素和内部论看，它涉及的是肿瘤发生发展的内部因素和内部矛盾性。随着它的迅速发展，为肿瘤的免疫治疗提矛盾性。随着它的迅速发展，为肿瘤的免疫治疗提出了广泛的可能。出了广泛的可能。从宿主与肿瘤相互斗争这一矛盾出发，从增强宿主从宿主与肿瘤相互斗争这一矛盾出发，从增强宿主对肿瘤的免疫能力，以及消除肿瘤对免疫功能的抑对肿瘤的免疫能力，以及消除肿瘤对免疫功能的抑制两个方面入手，并继续在增强机体非特异性免疫制两个方面入手，并继续在增强机体非特异性免疫能力方面进行研究，肿瘤的免疫治疗是大有希望的。能力方面进行研究，肿瘤的免疫治疗是大有希望的。1 1、增强宿主对肿瘤的免疫能力：、增强宿主对肿瘤的免疫能力：1）提纯改造抗原，提高抗原的免疫作用）提纯改造抗原，提高抗原的免疫作用2）发挥细胞免疫的作用进行过继免疫治疗）发挥细胞免疫的作用进行过继免疫治疗3）利用细胞因子激活抗肿瘤免疫）利用细胞因子激活抗肿瘤免疫4）抗体导向治疗）抗体导向治疗2 2、消除肿瘤对免疫的对抗、消除肿瘤对免疫的对抗 如何清除免疫抑制因子的作用，是肿瘤免疫治疗很如何清除免疫抑制因子的作用，是肿瘤免疫治疗很有希望的一个方面。有希望的一个方面。五、免疫治疗的评价1、临床评价：、临床评价：病灶变化病灶变化-临床查体和影像学检查（临床查体和影像学检查（CT、MRI、B超、等）超、等）内镜检查内镜检查 肿瘤标志物肿瘤标志物 肝功、肾功、血象等的改善肝功、肾功、血象等的改善 其他其他肿瘤标志物（TUMOR MARKERS,TM)1978年年NCI提出提出1979年确认并开始使用年确认并开始使用TM是表示肿瘤存在并反映其一定的生物特性的是表示肿瘤存在并反映其一定的生物特性的生化物质生化物质TM主要是指那些在血液、体液及组织中可检测主要是指那些在血液、体液及组织中可检测到的与肿瘤相关的物质，这些物质达到一定的到的与肿瘤相关的物质，这些物质达到一定的水平时能揭示某些肿瘤的存在。水平时能揭示某些肿瘤的存在。TM的临床意义：的临床意义：（1）诊断）诊断 （2）复发（）复发（3）判断疗效（）判断疗效（4）预）预后后常用肿瘤标志物甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（癌胚抗原（CEACEA）糖类抗原（糖类抗原（CA50CA50、CA125CA125、CA15-3CA15-3、CA199CA199、CA242CA242、CA72-4CA72-4）2-2-微球蛋白（微球蛋白（2-MG2-MG）铁蛋白（铁蛋白（FtFt）细胞角质素片段抗原细胞角质素片段抗原21-1（CYFRA21-1）神经元特异性烯醇化酶（神经元特异性烯醇化酶（NSE）鳞状上皮癌相关抗原（鳞状上皮癌相关抗原（SCC-Ag）前列腺特异抗原（前列腺特异抗原（PSA）前列腺酸性磷酸酶（前列腺酸性磷酸酶（PAP）核基质核基质2、免疫监测、免疫监测 -观察观察CTL的反应、认定的反应、认定CTL反应的细胞类型、反应的细胞类型、等，从而评价机体对免疫治疗的反应等，从而评价机体对免疫治疗的反应1）迟发超敏试验（）迟发超敏试验（DTH）-体内抗原特异性免疫监测技术体内抗原特异性免疫监测技术2）机体免疫功能检测）机体免疫功能检测 体液免疫体液免疫指标：定量分析抗原特异性抗体的数量指标：定量分析抗原特异性抗体的数量和功能和功能检验科检验科 细胞免疫细胞免疫功能：功能：FCM技术检测淋巴细胞表面标志技术检测淋巴细胞表面标志 CD3、CD4、CD8、CD19、CD28、CD16/CD56、CD25、HLA-DR、等等。、等等。实验实验室室 Th1、Th2类因子检测类因子检测：应用：应用FCM-CBA技术，采技术，采用磁珠微阵列技术，同时测定血清中用磁珠微阵列技术，同时测定血清中46种免疫相种免疫相关因子的水平关因子的水平实验实验室室3）T细胞增殖反应细胞增殖反应 -3H测定法测定法4）T细胞毒性检测：细胞毒性检测：51Cr释放试验释放试验 LDH MTT（WST-1）5）T细胞限制性稀释分析法（细胞限制性稀释分析法（LDA）-分析未知频率的淋巴细胞克隆、定量检测外周血分析未知频率的淋巴细胞克隆、定量检测外周血中最初抗原中最初抗原T特异性淋巴细胞的数目或频率。特异性淋巴细胞的数目或频率。操作复杂，被操作复杂，被ELISPOT等新技术所取代等新技术所取代6）细胞因子检测）细胞因子检测 -测定测定T淋巴细胞分泌的因子淋巴细胞分泌的因子ELISA（酶联免疫技术）（酶联免疫技术）-检测检测T淋巴细胞分泌淋巴细胞分泌于细胞外的因子于细胞外的因子ELISPOT（酶联免疫斑点技术）（酶联免疫斑点技术）-检测检测T淋巴淋巴细胞分泌于细胞外的因子细胞分泌于细胞外的因子FCM（流式细胞术）（流式细胞术）-检测检测T淋巴细胞胞内细淋巴细胞胞内细胞因子胞因子7）其他）其他P-MHC tetramer技术技术-检测细胞表面受体（检测细胞表面受体（TCR）与与MHC分子递呈的多肽的相互作用分子递呈的多肽的相互作用定量定量PCR技术技术-检测细胞因子基因、检测细胞因子基因、T细胞受体复合细胞受体复合物基因等表达水平，反应物基因等表达水平，反应T淋巴细胞功能状态淋巴细胞功能状态 六、肿瘤免疫治疗的新进展1、免疫卡控点抑制剂 Checkpoimt inhibitor CTLA4、PD-1、PD-L1 2、TCR-T和CAR-TT TB7B7CD28CD28MHC-IMHC-IAgAgTCRTCRTCRTCRAgAgMHC-IMHC-IIL-2IL-2APCAPCTumorTumorT TT TT TT TT T耐受耐受激活激活CD28CD28协同刺激分子作用示意图协同刺激分子作用示意图T T1、T细胞免疫卡控点治疗有两种受体存在于有两种受体存在于T细胞表面细胞表面B7 CD28 低亲和力受体低亲和力受体 CTLA-4 高亲和力受体高亲和力受体B7 B7 传递阳性或阴性信号决定于传递阳性或阴性信号决定于传递阳性或阴性信号决定于