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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2.2,动物细胞工程,生产单克隆抗体,等,动物细胞工程惯用技术,动物细胞培养,动物细胞核移植,动物细胞融合,是其它动物细胞工程技术基础。,第1页,为何要进行动物细胞培养,?,一,.,动物细胞培养,怎样进行细胞培养,?,2.2.1,动物细胞培养和核移植技术,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜培养基中，让这些细胞生长和增殖。,(,一,),概念,试验材料，药性、毒性检测，提取细胞分泌物等,第2页,第3页,第4页,1.,进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质主要是什么成份？用胃蛋白酶行吗？,P44,旁栏,提醒：用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间物质主要是蛋白质。胃蛋白酶作用适宜,pH,约为,2,，当,pH,大于,6,时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用适宜环境,pH,为,7.2,8.4,。多数动物细胞培养适宜,pH,为,7.2,7.4,，胃蛋白酶在此环境中没有活性，而胰蛋白酶在此环境中活性较高，所以胰蛋白酶适宜用于细胞培养时消化。,第5页,胰蛋白酶真不会把细胞消化掉吗？为何？,P44,寻根问底,提醒：胰蛋白酶除了能够消化细胞间蛋白外，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，所以必须控制好胰蛋白酶消化时间。,第6页,(,二,),动物细胞培养过程,胚胎或幼龄动物组织器官,细胞悬液,10,代细胞,50,代细胞,剪碎,胰蛋白酶或胶原蛋白酶,洗涤、稀释、分离,原代培养,用,胰蛋白酶,分,散细胞，说明细胞间物质主要是,蛋白质,。,动物细胞培养适宜,PH,为,7.2,7.4,，此环境下胃蛋白酶（,2.0,）没有活性，而胰蛋白酶,(7.2-8.4),活性较高,。,比老龄动物组织细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛。分化程度越低，繁殖能力越强，越轻易培养。,动物细胞培养不能最终培养成生物体,细胞增殖迟缓，核型可能改变,动物组织细胞间隙中含有一定量弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成含有一定弹性和韧性组织和器官。,贴壁生长,接触抑制,10,代以内，保持正常二倍体核型,传代培养,第7页,动物组织块,细胞悬液,原代培养,传代培养,胰蛋白酶处理分散成单个细胞,幼龄动物器官组织；动物胚胎,细胞贴壁,接触抑制,原代培养,传代培养,加入培养液,用胰蛋白酶等处理贴壁细胞,适宜条件,不死性细胞,第8页,细胞悬浮液,10,代细胞,50,代细胞,无限传代,原代培养（普通）,传代培养,原代培养和传代培养、细胞株和细胞系,多数组织细胞固定在表面生长和分裂。叫做？,随细胞增多，细胞就会停顿分裂增殖,第9页,多细胞动物和人体细胞都生活在内环境中，依据你所学内环境知识，思索以下问题：,1.,体外培养细胞时需要提供哪些物质？,2.,体外培养细胞需要什么样环境条件？,P46,讨 论,充分营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成份及血清、血浆等天然成份。）,适宜温度、,PH,和气体环境；无菌无毒环境,第10页,(,三,),动物细胞培养条件,P46,1,、无菌、无毒环境（无菌处理和添加抗生素目标？更换培养液好处？）,2,、营养与体内相同。合成培养基：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，通常需加入血清、血浆等一些天然成份。,3,、,温度,和,PH,，,36,37,、,7.27.4,）,4,、,气体环境,95%,空气、,5%CO,2-,维持培养液,PH,）,第11页,植物组织培养和动物细胞培养比较,第12页,对比：动物细胞培养、植物组织培养,.,.,细胞全能性,细胞有丝分裂,固体,营养物质,激素,液体,营养物质,血清,等,完整植株,细胞群或细胞产物,无,有,有,无,植物,组织,培养技术是植物细胞工程技术基础。,动物,细胞,培养技术是动物细胞工程技术基础。,复习,植物细胞工程,和,动物细胞工程部分内容,。,第13页,P47,最上面,1,、大规模生产生物制品。,2,、培养动物细胞作为基因工程受体细胞。,3,、检测判断物质毒性。,4,、培养正常或各种病变细胞，用于生理、病理、药理等方面研究，如用于,等，为,及其它疾病提供理论依据。,(,四,),动物细胞培养技术应用,筛选抗癌药品,治疗和预防癌症,第14页,1,关于动物细胞培养相关叙述中正确是,A,细胞癌变发生于原代培养向传代培养过渡过程中,B,动物细胞培养液中通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、生长素和动物血清,C,动物细胞培养目标只是取得大量细胞分泌蛋白,D,动物细胞培养前和培养过程中都需要用胰蛋白酶处理,第15页,第16页,相互接触,接触抑制,单层,胰蛋白酶,衰老或死亡,不死性,降低,降低,第17页,活细胞膜含有,选择透过性，大分子染料不能进入细胞，故不染色。,中,低温,新陈代谢,酶,抗原,第18页,二,.,动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新胚胎，这个新胚胎最终发育为,动物个体（克隆动物）,分,类,胚胎细胞核移植：,体细胞核移植：,细胞分化程度低，恢复全能性轻易,细胞分化程度高，恢复全能性不轻易,(,一,),、动物细胞核移植概念：,第19页,(,二,),、体细胞核移植过程：,请看教材,P48,图,2-21,思索：,1.,核移植受体细胞是什么？处于什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？,2.,经过什么伎俩激活受体细胞，构建重组胚胎？,M,中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成,细胞分裂和发育进程。,卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需营养；含有激活细胞核表达全能性物质。,第20页,电激处理使供体核进入受体卵母细胞构建重组胚胎,卵母细胞采集、培养,M,期,卵母细胞,供体牛,供体细胞注入去核卵母细胞,代孕母牛,克隆牛,体细胞培养,去核卵母细胞,去核,胚胎,移植,体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）,第21页,整个过程用了哪些技术？,细胞培养、核移植、胚胎移植,新生牛性别、基因？,与供体相同,繁殖方式？,无性繁殖,原理？,动物细胞,核,全能性,第22页,第23页,(,二,),、体细胞核移植过程：,第24页,第25页,母绵羊,A,乳腺细胞（体细胞）,母绵羊,B,未受精卵细胞,母绵羊,C,“,多莉,”,新卵细胞发育成早期胚胎,去核卵细胞,提取细胞核,核移植,胚胎移植,体细胞核移植技术,克隆羊,第26页,第27页,步骤一：从一只,6,岁芬兰多塞特白面母绵羊（姑且称为,A,）乳腺中取出乳腺细胞，将其放入低浓度营养培养液中，细胞逐步停顿分裂，此细胞称之为“供体细胞”；,步骤二：从一头苏格兰黑面母绵羊（,B,）卵巢中取出未受精卵细胞，并马上将细胞核除去，留下一个无核卵细胞，此细胞称之为“受体细胞”,步骤三：利用电脉冲方法，使供体细胞和受体细胞融合，最终形成“融合细胞”。电脉冲能够产生类似于自然受精过程中一系列反应，使融合细胞也能像受精卵一样进行细胞分裂、分化，从而形成“胚胎细胞”；,步骤四：将胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊（,C,）子宫内，胚胎细胞深入分化和发育，最终形成小绵羊,-,多莉。,换言之，多莉有,3,个母亲：基因母亲，提供基因组；线粒体母亲，提供去核卵细胞；代孕母亲，将多莉生下来。有意思是即使有三个母亲但多莉没有父亲。,第28页,第29页,第30页,第31页,第32页,第33页,第34页,P49,讨论：,1.,在体细胞细胞核移植到受体卵母细胞之前，为何必须先去掉受体卵母细胞核？,为使核移植胚胎或动物遗传物质全部,来自有主要利用价值动物提供体细胞，在,供体细胞细胞核移至受体细胞之前，必须将,受体细胞遗传物质去掉或将其破坏,(P49,小资料）。,第35页,培养动物细胞普通当传代至,10,50,代左,右时，部分细胞核型可能会发生改变，其细胞,遗传物质可能会发生突变，而,10,代以内细胞,普通能保持正常二倍体核型。所以，在体细,胞核移植中，为了确保供体细胞正常遗传基,础，通常采取传代,10,代以内细胞。,2.,用于核移植供体细胞普通都选取传代,10,代以内细胞，想一想，这是为何？,第36页,3.,你认为用上述体细胞核移植方法生产克隆动物，是对体细胞供体动物进行了,100%,复制吗？为何？,绝大部分,DNA,来自于供体细胞核，但其核外还有,少许,DNA,，即线粒体中,DNA,是来自于受体卵,母细胞。,另外，即便动物遗传基础完全相同，但动物,一些行为、习性形成与所处环境有很大关系，,核供体动物生活环境与克隆动物所生活环境,不会完全相同，其形成行为、习性也不可能和,核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物,不会是核供体动物,100%,复制。,第37页,(,三,),、体细胞核移植技术应用前景：,1,、在畜牧业中能够加速家畜遗传改良进程,2,、保护濒危物种,3,、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官移植,4,、了解胚胎发育和,衰老过程；追踪研,究疾病发展过程,和治疗疾病,第38页,第39页,第40页,阅读书本,P50,页,(,四,),、体细胞核移植技术存在问题：,第41页,思索与探究,1.,幼龄与老龄动物组织细胞比较，分化程度低与分化程度高组织细胞比较，哪一个更易于培养？思索一下，这是什么道理？,提醒：细胞衰老与动物机体衰老有着亲密关系，细胞增殖能力与供体年纪相关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。所以，普通来说幼年动物组织细胞比老年动物组织细胞易于培养。一样，组织细胞分化程度越低，则增殖能力越强，所以更轻易培养。,第42页,思索与探究,2.,动物细胞培养要经过脱分化过程吗？为何？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时脱分化过程了。要想使培养动物细胞定向分化，通常采取定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要组织或器官。,第43页,3.1997,年，美国威斯康星州一个奶牛场有一头,名叫卢辛达（,Lucinda,）奶牛，年产奶量为,30.8 t,，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目,前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量普通,为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为,3,4 t,。,（,1,）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,第44页,能够。卢辛达产奶量很高，有高产奶遗传基础，利用卢辛达体细胞克隆奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛含有高产遗传基础，假如精心培育和喂养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产公牛自然繁殖，可得到很多高产后代，从而加紧奶牛改良进程。,该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限繁殖，以防止奶牛群出现近亲繁殖而引发种质衰退。,第45页,（,2,）假如将克隆高产奶牛卢辛达任务交给你，你将怎样对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别组织、器官，耳朵在活体上轻易取）上剪取一小块组织，在体外培养取得该组织（如软骨组织）细胞。从屠宰场取废弃牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂胚胎植入经同期发情处理受体母牛体内。,第46页,4.,体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。,应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,第47页,动物细胞培养与植物组织培养主要区分在于,A,、培养基不一样,B,、动物细胞培养不需要在无菌条件下进行,C,、动物细胞能够传代培养，而植物细胞不能,D,、动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能,培养成植株,巩固练习,A,第48页,动物细胞工程技术基础是,A,、动物细胞融合,B,、胚胎移植,C,、动物细胞培养,D,、核移植,巩固练习,在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变细胞,是,A,、细胞系,B,、细胞株,C,、原代细胞,D,、传代细胞,C,A,第49页,以下不属于克隆是,A,、生物体经过体细胞进行无性繁殖,B,、将某肿瘤细胞在体外培养繁殖成一个细胞系,C,、扦插和嫁接,D,、将鸡某个,DNA,片段整合到小鼠,DNA,中,巩固练习,D,第50页,植物体细胞杂交,结果,是,A,、产生杂种植株,B,、产生杂交细胞,C,、原生质体融合,D,、形成愈伤组织,巩固练习,A,植物体细胞杂交,目标,是,A,、产生杂种植株,B,、产生杂交细胞,C,、原生质体融合,D,、形成愈伤组织,A,第51页,植物体细胞杂交能够处理不一样生物之间,问题,A,、亲缘关系远,B,、地理隔离,C,、生殖隔离,D,、组织分化,巩固练习,以下细胞中，不含有细胞全能性特点细胞是,A,、心肌细胞,B,、神经细胞,C,、根皮层细胞,D,、木质部导管细胞,C,D,第52页,知识拓展,1,.,动物细胞培养技术是怎样发展起来？,19，哈里森（Harrison）在无菌条件下用淋巴液作培养基，培养蛙胚神经组织存活数周，并观察到神经细胞突起生长过程，由此创建了盖片覆盖凹窝玻璃悬滴培养法，奠定了动物组织体外培养基础。之后，又有些人将悬滴培养法改良为双盖片培养，提升了传代效率并降低了污染。1923年，卡雷尔（Carrel）设计了卡氏瓶培养法，扩大了组织生存空间。1951年，厄尔（Earle）创造了体外培养动物细胞人工合成培养基。1951年，波米拉（Pomerat）设计了灌流小室，使细胞生活在不停更新培养液中，便于作显微摄影和细胞代谢研究。1957年，格拉夫（Graff）用灌流技术深入提升了细胞悬浮培养效率。1957年，杜尔贝科（Dulbecco）等人采取胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基方法，取得了单层细胞培养。单层培养法出现，对组织培养发展起了很大推进作用。今后单层培养成为组织培养普遍应用技术。20世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展。20世纪80年代后，伴随基因工程和其它细胞工程技术发展，细胞培养技术已成为转基因技术、生物制药及其它许多技术基础，在当代生物技术中发挥着主要作用。,第53页,知识拓展,2,.,为何动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化是什么物质？,细胞原代培养时能够分散成单个细胞培养，也能够用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。,分散成单个细胞、细胞群（团）后轻易培养，细胞所需营养轻易供给，其代谢废物轻易排出；而用大块组织培养时，内部细胞营养供给和代谢废物排出都较困难，所以，这些细胞在体外长时间生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作其它技术得以实现。,用酶消化是细胞间基质，细胞间基质主要成份有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成份。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。,第54页,知识拓展,3,.,体细胞核移植技术为何要选择,M,期卵母细胞做受体细胞？,细胞核移植技术中能用作受体细胞通常有,M,期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中惯用受精卵，以后基本上用,M,期卵母细胞取代了受精卵，主要因为二者细胞质环境不一样。有些人认为重组需要因子存在于,M,期卵母细胞胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，所以，原核扩张后受精卵去核可引发胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（,MPF,）是卵母细胞细胞质中主要胞质影响因子，,MPF,活性在卵母细胞减数分裂,MI,期和,M,期到达最高，受精或激活后，,MPF,快速灭活，所以，,M,期卵母细胞中,MPF,活性高，而受精卵中,MPF,活性低。,MPF,水平高低可影响供体核染色质状态和复制。,M,期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而,MI,卵母细胞细胞核、细胞质还未成熟，其细胞质不能支持胚胎全程发育，所以，尽管,MI,期卵母细胞,MPF,活性也高，但不能用作受体卵母细胞。,也有些人认为用去核合子做受体时，可能因为合子去核时一些早期发育必需因子随原核去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。所以，当前广泛采取,M,期卵母细胞做受体。,第55页,
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