电针心包经穴对脑缺血大鼠不同时点脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响.pdf

中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期电针心包经穴对脑缺血大鼠不同时点脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响肖豆 1，马文娟 2，唐雅妮 3，谢峥嵘 4，潘江 4，刘民权 4，章薇 4，陈成 41.同济大学附属杨浦医院，上海 200090；2.长沙市中医医院，长沙市第八医院，湖南 长沙 410100；3.长沙民政职业技术学院，湖南 长沙 410004；4.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007摘要：目的探究电针心包经穴对大鼠脑缺血后神经修复的影响及作用机制。方法150只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心包经组和肺经组，以颈外动脉插入线栓法制备大脑中动脉栓塞（MCAO）大鼠模型。心包经组选取“天泉”“曲泽”“内关”“大陵”，肺经组选取“天府”“尺泽”“列缺”“太渊”，每日电针1次，干预6 d休息1 d，分别于3、7、14、21、28 d进行取材。HE染色观察大鼠缺血侧脑组织病理改变，免疫组化染色和Western blot检测脑组织髓鞘相关生长抑制因子A（Nogo-A）、Nogo受体1（NgR1）蛋白表达。结果与正常组、假手术组比较，模型组大鼠各时点缺血侧脑组织神经细胞消失或皱缩，细胞间距增大，Nogo-A和NgR1蛋白表达明显升高（P0.01）；与模型组比较，心包经组和肺经组大鼠缺血侧脑组织神经细胞数量增加，形态结构改善，各时点Nogo-A和NgR1蛋白表达明显降低（P0.01，P0.05）；与肺经组比较，心包经组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达降低更明显（P0.01，P0.05）。结论电针心包经穴能在一定程度上调节MCAO模型大鼠神经轴突发芽和再生微环境，其机制与抑制不同时点缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达有关。关键词：脑缺血；心包经穴；电针；神经生长抑制因子；大鼠中图分类号：R245.3 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2023)08-0113-07DOI：10.19879/ki.1005-5304.202206482开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effects of Stimulating Acupoints of Pericardium Meridian with Electroacupuncture on Nogo-A and NgR1 Protein Expressions in Brain Tissue of Cerebral Ischemia Rats at Different Time PointsXIAO Dou1,MA Wenjuan2,TANG Yani3,XIE Zhengrong4,PAN Jiang4,LIU Minquan4,ZHANG Wei4,CHEN Cheng41.Yangpu Hospital,Tongji University,Shanghai 200090,China;2.Changsha Hospital of Traditional Chinese Medicine,Changsha Eighth Hospital,Changsha 410100,China;3.Changsha Social Work College,Changsha 410004,China;4.The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine,Changsha 410007,ChinaAbstract:Objective To explore the effect and mechanism of nerve repair by electroacupuncture at acupoints of pericardium meridian after cerebral ischemia in rats.Methods Totally 150 SD rats were randomly divided into normal group,sham-operation group,model group,pericardial meridian group and lung meridian group.A rat model of middle cerebral artery occlusion(MCAO)was established by inserting a suture into the external carotid artery.The pericardium meridian group selected“Tianquan”(PC2),“Quze”(PC3),“Neiguan”(PC6)and“Daling”(PC7),and the lung meridian group selected“Tianfu”(LU3),“Chize”(LU5),“Lieque”(LU7)and“Taiyuan”(LU9).基金项目：国家自然科学基金（81704184、82105002）；湖南省自然科学基金（2022JJ40329、2022JJ30456）；湖南中医药大学一流学科开放基金（2018YXJS09）；湖南中医药大学第一附属医院中医康复服务能力项目（KF201905）；同济大学附属杨浦医院晨光计划（Ye1202107）；湖南省中医药管理局项目（D2022008）通讯作者：陈成，E-mail：succeed_实验研究113Aug.2023 Vol.30 No.8 Chinese Journal of Information on TCMElectroacupuncture was performed once a day,6 days of intervention and 1 day of rest,materials were collected on 3,7,14,21,and 28 day of intervention,respectively.Pathological changes of ischemic brain tissue in rats were observed by HE staining,Nogo-A and NgR1 protein expressions in brain tissue were detected by immunohistochemical staining and Western blot.Results Compared with the normal group and the sham-operation group,the nerve cells in ischemic brain tissue of the rats in model group disappeared or shrunken at each time point,the distance between the cells increased,and the expressions of Nogo-A and NgR1 proteins significantly increased(P0.01).Compared with the model group,the number of nerve cells in ischemic brain tissue of the rats in pericardium meridian group and lung meridian group increased,the morphological structure was improved,and the protein expressions of Nogo-A and NgR1 protein at each time point significantly decreased(P0.01,P0.05).Compared with the lung meridian group,the expressions of Nogo-A and NgR1 proteins in ischemic brain tissue of the pericardium meridian group significantly decreased(P0.01,P0.05).Conclusion Electroacupuncture stimulation at acupoints of pericardium meridian can regulate the neural axon sprouting and regeneration microenvironment in MCAO model rats,and its mechanism is related to the inhibition of Nogo-A and NgR1 protein expression in ischemic brain tissue at different time points.Keywords:cerebral ischemia;acupoints of pericardium meridian;electroacupuncture;neuronal growth inhibitory factor;rats脑缺血是因大脑血液循环受阻，缺血、缺氧导致局限性脑组织缺血性坏死或软化，进而引起相应神经系统功能缺损的一种疾病。患者脑缺血后多伴有肢体功能障碍，甚至造成终身残疾。神经修复是促进脑缺血患者神经功能康复的重要途径1。研究认为，神经功能因子及炎症介质的相互作用是影响神经修复的关键因素2。其中髓鞘相关生长抑制因子A（Nogo-A）与Nogo受体1（NgR1）均具有抑制神经细胞迁移和扩散、阻碍轴突再生的作用3-4，通过消除或减少上述抑制因子，能达到促进神经再生及脑缺血后中枢神经修复的作用5-6。本研究基于Nogo-A/NgR1信号通路观察电针心包经穴对大脑中动脉栓塞（MCAO）模型大鼠不同时点脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响，探讨电针对脑缺血损伤后神经修复的作用机制。1材料与方法材料与方法1.1动物SPF级雄性SD大鼠150只，体质量220250 g，34月龄，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2016-0002。饲养于温度22、湿度55%70%环境。实验过程遵守实验动物管理和使用规定。1.2主要试剂与仪器Nogo-A抗体（美国Proteintech公司，货号10740-1-Ap），NgR1抗体（博奥森公司，货号bs-0129R），-actin抗体（美国Proteintech公司，货号66009-1-Ig），二抗鼠抗体（美国Proteintech公司，货号SA00001-1），二抗兔抗体（美国Proteintech公司，货号SA00001-2），RIPA裂解液（上海碧云天公司，货号P0013B）。0.30 mm15 mm华佗牌毫针、SDZ-华佗电针治疗仪（苏州医疗用品厂有限公司），DYY-6C电泳仪（北京六一仪器厂），YD-315切片机（浙江金华益迪试验器材），DYCZ-40D转膜仪（北京六一仪器厂）。1.3分组与造模将150只SD大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、心包经组和肺经组，每组30只，各组再分为3、7、14、21、28 d 5个时间点，每个时间点各6只。造模前禁食1 d，参照Longa7和Koizumi8造模方法，以颈外动脉插入线栓法制备MCAO大鼠模型。正常组不做任何处理，假手术组仅暴露血管。造模后次日，采用Longa 5级4分制评分法7评分：无神经功能缺损计0分，缺血对侧伸直障碍、前爪内收计1分，行走向偏瘫侧转圈计2分，行走向偏瘫侧倾倒计3分，完全丧失意识、不能行走计4分。选取评分13分大鼠纳入实验。1.4干预造模成功次日开始电针干预，参照实验针灸学9动物穴位图谱取穴。心包经组选取“天泉”“曲泽”“内关”“大陵”，肺经组选取“天府”“尺泽”“列缺”“太渊”，用毫针刺入缺血对侧穴位34 mm，接通电针治疗仪，心包经组“天泉”“曲泽”相连、“内关”“大陵”相连，肺经组“天府”“尺泽”相连、“列缺”“太渊”相连，选用连续波，电压24 V，电流46 mA，强度以局部组织轻颤为度。每次30 min，每日1次，连续6 d，休息1 d，继续干预至28 d。1.5HE染色分别于电针3、7、14、21、28 d取相应大鼠，颈114中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期椎脱臼处死，断头取脑，参照大鼠脑立体定位图谱10，模型组、心包经组和肺经组切取左侧视交叉至脑桥属大脑中动脉供血区域，正常组和假手术组参照上述部位取材。脱水、包埋、切片后，60 烤片12 h，切片置于二甲苯中10 min2次。100%、100%、95%、85%、75%乙醇依次放置5 min，蒸馏水洗5 min，苏木素染色510 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝，伊红染35 min，蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，置于二甲苯中10 min2次，中性树胶封片，显微镜下观察。1.6免疫组化染色取大鼠缺血侧脑组织，用4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片，切片脱蜡至水，浸入柠檬酸盐缓冲液，微波炉加热至沸腾，连续煮25 min，冷却至室温，PBS洗涤3 min3次进行热修复抗原，灭活内源性酶后，滴加 Nogo-A、NgR1 一抗（1200），4 孵育过夜。PBS冲洗5 min3次，加二抗，37 孵育30 min，PBS冲洗5 min3次，DAB显色，苏木素复染510 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝后显微镜下观察，随机选择5个不重叠视野采集图像，Image-Pro Plus 6.0软件分析每个视野阳性表达的平均光密度（阳性染色为棕黄色）。1.7Western blot检测取缺血侧脑组织，每100 mg组织加入RIPA裂解液1 mL研磨，冰上裂解10 min，4、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液加热变性后，电泳，转移至NC膜，用5%脱脂奶粉室温封闭60 min，分别加入Nogo-A一抗（1 800）、NgR1一抗（11 500）、-actin一抗（15 000），4 孵育过夜，加入相应二抗（15 000），室温孵育90 min。使用ECL化学发光液显影，用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。以-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白灰度值/-actin灰度值）。1.8统计学方法采用SPSS20.0统计软件进行分析。计量资料用x s表示，符合正态分布多组间比较用方差分析，不符合正态分布用多个独立样本比较的秩和检验。P0.05表示差异有统计学意义。2结果结果2.1电针对模型大鼠缺血侧脑组织病理变化的影响正常组、假手术组大鼠各时点脑组织结构完整、清晰致密，神经元细胞胞质丰富，可见较大清晰核仁；模型组大鼠各时点脑组织可见大片梗死灶，神经细胞消失或皱缩，细胞核固缩，核边集严重，细胞间距增大，间质染色稀疏；心包经组和肺经组大鼠各时点缺血脑组织细胞排列相对规则，较模型组结构紧密。心包经组脑组织结构较同时点肺经组稍紧密、细胞排列稍规则。结果见图1。2.2电针对模型大鼠缺血侧脑组织髓鞘相关生长抑制因子A、Nogo受体1表达的影响免疫组化结果显示，与正常组、假手术组比较，模型组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1表达明显升高（P0.01）；与模型组比较，心包经组和肺经组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1表达明显降低（P0.05，P0.01）；与肺经组比较，心包经组大鼠7、28 d脑组织Nogo-A表达明显降低（P0.05，P0.01），各时点NgR1表达明显降低（P0.05，P0.01）。见图2、图3、表1、表2。图1各组大鼠缺血侧脑组织形态（HE染色，400）115Aug.2023 Vol.30 No.8 Chinese Journal of Information on TCM图2各组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A阳性表达（免疫组化染色，400）图3各组大鼠缺血侧脑组织NgR1阳性表达（免疫组化染色，400）表1各组大鼠缺血侧脑组织不同时点Nogo-A表达比较（x s，平均光密度）组别正常组假手术组模型组心包经组肺经组只数666663 d0.000 60.000 30.000 70.000 40.005 00.001 10.001 70.000 50.002 80.001 07 d0.000 60.000 20.001 00.000 30.019 50.002 40.007 10.001 10.010 30.001 414 d0.000 80.000 30.000 50.000 20.005 70.001 10.003 20.000 90.003 00.000 721 d0.000 70.000 30.000 60.000 30.031 30.002 80.014 70.002 00.015 90.002 628 d0.000 50.000 20.000 70.000 20.029 50.002 80.005 10.001 40.011 30.002 5注：与正常组、假手术组比较，P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01；与肺经组比较，P0.05，P0.01表2各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1表达比较（x s，平均光密度）组别正常组假手术组模型组心包经组肺经组只数666663 d0.003 20.000 80.003 70.001 60.020 10.002 80.003 90.001 50.012 90.003 17 d0.003 90.001 20.003 30.001 20.027 50.003 30.005 00.001 60.007 70.001 514 d0.003 40.001 20.002 80.001 20.050 60.007 70.012 60.002 10.017 40.002 821 d0.002 90.001 10.003 60.001 10.031 10.002 80.013 00.001 90.027 80.004 628 d0.003 90.001 10.003 20.001 00.053 90.004 00.024 00.003 70.028 90.004 2注：与正常组、假手术组比较，P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01；与肺经组比较，P0.05，P0.01116中国中医药信息杂志2023 年 8 月第 30 卷第 8 期Western blot结果显示，与正常组、假手术组比较，模型组大鼠各时点脑组织Nogo-A、NgR1蛋白表达明显升高（P0.01）；与模型组比较，除14 d外，心包经组大鼠脑组织Nogo-A蛋白表达明显降低（P0.05，P0.01），各时点NgR1蛋白表达明显降低（P0.01）；与肺经组比较，心包经组大鼠3、7 d脑组织Nogo-A蛋白表达明显降低（P0.01，P0.05），各时点NgR1蛋白表达明显降低（P0.01）。见图4、表3、表4。3讨论讨论脑缺血是危害人类健康的主要疾病之一，且发病年龄呈现年轻化趋势11-12。研究发现，脑缺血后，因脑部缺血、缺氧和系列炎症反应导致神经细胞损伤，使患者出现严重的神经功能障碍13。促进神经修复成为脑缺血患者后期康复的重点和难点。电针作为中医传统针刺疗法与现代电刺激相结合的治疗方式，在脑缺血康复治疗中疗效显著，其作用机理是目前研究的热点。电针能有效调控内环境中神经生长因子和神经生长抑制因子含量14，改善脑组织血液循环15和能量代谢16，抑制细胞凋亡17-18和炎症反应19。但目前对于脑缺血的研究大多基于“通督调神”“治痿独取阳明”等理论开展，电针心包经与其他经脉对照的研究报道较少。从经脉循行来看，心包经可通过其络脉、阴维脉、任脉与脑间接联系。且针灸甲乙经 针灸大成 外台秘要 铜人腧穴针灸图经等古籍皆记载心包经腧穴可治疗中风诸症20。临床研究表明，针刺 注：A.正常组；B.假手术组；C.模型组；D.心包经组；E.肺经组图4各组大鼠缺血侧脑组织Nogo-A、NgR1蛋白免疫印迹表3各组大鼠缺血侧脑组织不同时点Nogo-A蛋白表达比较（x s，相对表达量）组别正常组假手术组模型组心包经组肺经组只数666663 d0.090.020.090.030.330.090.240.040.350.107 d0.110.030.120.030.350.070.250.100.340.0614 d0.110.040.110.040.350.070.290.040.420.1121 d0.110.020.100.020.330.040.250.030.330.0928 d0.150.060.140.040.390.090.300.070.380.09注：与正常组、假手术组比较，P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01；与肺经组比较，P0.05，P0.01表4各组大鼠缺血侧脑组织不同时点NgR1蛋白表达比较（x s，相对表达量）组别正常组假手术组模型组心包经组肺经组只数666663 d0.090.020.090.020.300.070.110.030.230.077 d0.090.030.100.040.360.060.200.060.290.0614 d0.070.020.080.020.380.050.270.050.330.0621 d0.110.040.130.040.350.030.250.040.360.0528 d0.110.030.130.030.370.050.240.040.360.05注：与正常组、假手术组比较，P0.01；与模型组比较，P0.05，P0.01；与肺经组比较，P0.05，P0.01117Aug.2023 Vol.30 No.8 Chinese Journal of Information on TCM心包经腧穴不仅能有效增加脑缺血患者脑血流量21，调节自主神经平衡22，还能有效缩短中风患者康复时间，防止肌肉萎缩和痉挛23-24。本研究团队长期从事电针心包经穴治疗脑缺血损伤相关研究，从抗炎、抗凋亡、促血管新生、神经递质与神经营养因子分泌、促进神经元突触发生、神经修复等多角度验证电针心包经穴对脑缺血损伤的效应机制25-29。基于前期研究成果，本研究从神经修复角度出发，观察电针心包经穴对MCAO大鼠脑组织Nogo-A及NgR1蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制，为“从心治脑”理论提供实验依据。研究表明，大鼠急性脑缺血后，缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达明显升高30-31，针刺干预在促进大鼠神经功能恢复的同时可明显降低脑组织Nogo-A与NgR1蛋白表达32。而Nogo-A抗体和/或NgR1拮抗剂在降低Nogo-A和/或NgR1表达同时，还能保护缺血后脑组织，在一定程度上促进神经修复及轴突再生33-34。由此推测，脑缺血损伤后，Nogo-A、NgR1含量增加，二者相互作用，激活下游相关通路，从而抑制轴突再生。脑缺血发展是一个复杂动态变化的过程，其病理损害随着时间发展而变化。而神经轴突再生需要分化完全的神经元重新接受出芽信号，激活分子生长程序，然后成长为轴突。有研究者认为，整个过程需要耗时2个月以上35-36。目前研究大多认为Nogo-A和NgR1表达在脑缺血后第7、14或21日达到峰值37-38，但尚无定论。故本实验设置多个时点观察脑缺血损伤后Nogo-A和NgR1表达变化及电针干预效应。本研究结果显示，模型组大鼠各时点缺血侧脑组织神经细胞大量凋亡，细胞间距增大、组织结构紊乱，脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达升高。电针心包经穴能改善大鼠缺血侧脑组织神经细胞形态，同时下调不同时点脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达，且在不同程度上优于肺经组。考虑可能是电针心包经穴能改善脑的血液循环，促进大脑侧支循环建立，使缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达降低，从而促进神经修复、改善组织形态结构，也有可能随着大鼠脑缺血时间的延长，内环境发生改变，抑制Nogo-A和NgR1蛋白表达，使神经自我再生和修复能力增强，进行发芽重塑形成新的轴突。此外，电针肺经穴也能抑制部分时点Nogo-A和NgR1蛋白表达，考虑肺“朝百脉，主治节”，同时有“主一身之气”的生理功能，能促进血液中浊气与清气互换，并将富含清气的血液输送到脑及全身各处39，具体原因还需进一步扩大实验样本量研究。本实验显示，不同检测方法和不同指标所表现的有效时间点不同，通过结果分析，7 d和14 d可能为最优干预时间点，但仍需要进一步实验验证。综上所述，电针心包经穴能抑制MCAO模型大鼠不同时点缺血脑组织Nogo-A和NgR1蛋白表达，调节轴突发芽和再生微环境，从而保护受损的神经细胞，起到神经修复作用。参考文献：1 夏毅,徐进友,王海东,等.自拟化痰通络方治疗脑梗死恢复早期痰瘀阻络证疗效及对脑血流动力学和血管神经修复因子的影响J.中国中医药信息杂志,2022,29(2):109-114.2 Berry M,Ahmed Z,Logan A.Return of function after CNS axon regeneration:Lessons from injury-responsive intrinsically photosensitive and alpha retinal ganglion cellsJ.Prog Retin Eye Res,2019,71:57-67.3 Li L,Deng B,Wang S,et al.Asynchronous therapy targeting Nogo-A enhances neurobehavioral recovery by reducing neuronal loss and promoting neurite outgrowth after cerebral ischemia in miceJ.J Drug Target,2016,24(1):13-23.4 Gou Z,Mi Y,Jiang F,et al.PirB is a novel potential therapeutic target for enhancing axonal regeneration and synaptic plasticity following CNS injury in mammalsJ.J Drug Target,2014,22(5):365-371.5 罗其中,包映晖,董斌.中枢神经损伤后的神经再生与修复策略J.中国微侵袭神经外科杂志,2004,9(2):49-52.6 Zhang Z G,Chopp M.Neurorestorative therapies for stroke:underlying mechanisms and translation to the clinicJ.Lancet 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