南京农大动物生物化学.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,第,17,章 核酸技术,Technology of Nucleic Acid,本章主要内容：,DNA,重组技术,基因鉴定,核酸技术的应用,对遗传分子核酸的结构与功能的阐明，用于研究核酸的工具酶的开发，由核酸的分子杂交性质建立起的一系列分析技术，使我们已经能够按照自己的意愿来摆布和操作基因，去改变生命有机体的遗传性状，甚至制造出新的物种，以服务于人类。重组,DNA,技术使人类千百年的梦想变为了现实。,一个梦想已成真,生长激素基因注入小鼠受精卵中培育出了,“,硕鼠,”,1.DNA,重组技术,DNA,重组技术,是利用多种限制性内切酶和,DNA,连接酶等工具酶，以,DNA,为操作对象，在细胞外将一种外源,DNA,（来自原核或真核生物）和载体,DNA,重新组合连接（重组），形成重组,DNA,，然后将重组,DNA,转入宿主细胞（如大肠杆菌等），使外源基因,DNA,在宿主细胞中随宿主细胞的繁殖而增殖，并在宿主细胞中得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,“,基因工程,”,（,gene engineering,）或,“,分子克隆,”,（,molecular cloning,）。,基因重组技术的,两个基本目的,1.,直接利用基因,主导生长的基因、,作物的抗性基因、,基因诊断、基因治疗、,指纹图谱等,2.,利用基因的表达产物,疫苗、药物、,组织激活物、,生长因子、,珍稀蛋白等,50,年来，核酸酶学的进步为,DNA,的分析与鉴定提供了有力的工具。主要的核酸酶有：,DNA,聚合酶（,DNA polymerase,）,klenow,片段，,Taq,酶,限制性核酸内切酶,（,restriction endonuclease,）,逆转录酶（,Reverse transcriptase,）,S,1,核酸酶（,S,1,nuclease,）,连接酶（,Ligase,）,拓扑异构酶（,Topoisomerase,）等,核酸酶学,限制性核酸内切酶,一把神奇的,“,手术刀,”,具有内切和甲基化两种功能,能够识别外源的核酸并将它切除,有特异的识别位点，通常为,4-8,对碱基的旋转对称结构,在其切口处留下黏性末端（,sticky end,）,具有互补序列,的单股链，或者平头末端（,blunt end,）,有,3,种类型，,II,型为主,例如：,Eco,RI,属,种,品系,排序,限制性内切酶（有专一的切点并常在切口处留下,黏性末端,）,目的基因克隆的技术路线,获得目的基因,选择合适的可以携带目的基因的载体,把目的基因插入到载体中去，得到重组载体,将重组载体导入宿主细胞进行克隆（,通过无性繁殖，随着宿主目的基因也得以扩增,）,对重组的克隆进行筛选,使重组的宿主细胞大规模的表达目的基因,黏性末端,（如质粒，噬菌体等）,（如细菌）,目的基因克隆的技术路线,利用表型特性，核酸杂交,以及免疫化学等方法对克,隆进行筛选,目的基因的制备,直接从染色体中分离,人工合成,逆转录合成,cDNA,cDNA,文库：用细胞全部,mRNA,经反转录制备全套,cDNA,后建库。,构建基因文库,PCR,扩增,质粒是可以独立复制,并在细菌之间转移的,遗传单位，质粒还能,赋予宿主菌某种表型,其他的基因载体还有,如：噬菌体，病毒等,目的基因的载体,plasmid DNA,Genomic DNA,含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过,规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）,古埃及一具木乃伊的一个,DNA,片段已经得到克隆,打开了人们窥探过去的窗户,2.,基因鉴定,聚合酶连锁反应,（,PCR,DNA polymerase chain reaction,）,目的基因可以通过以下系统在试管中得以大规模扩增,一个温度和时间可以控制的反应体系,含有双链,DNA,模板,耐热的,DNA,聚合酶（如,Taq,酶）,一对设计适当的,RNA,引物，,dNTP,原料，过量,经,“,变性,-,退火,-,延伸,”,多次循环使目的,DNA,得以扩增,DNA,核苷酸序列分析,Sanger,双脱氧链终止法,利用一个标记的（如用同位素标记），特异的，单股,DNA,或,RNA,片段,探针,（,probe,），,可以：,研究,DNA,之间的亲缘关系；,发现基因的缺失或突变；,测定某种遗传信息的量；,鉴定某种基因,基因治疗等,分子杂交,（,Molecular hybridization,）,分子杂交是一系列基因鉴定方法的基础,印迹技术（,Blotting,）,Southern blot,用探针鉴定,DNA,Northern blot,用探针鉴定,RNA,原位杂交（,Hybridization in situ,）,指纹分析（,Finger printing,）,基因芯片（,DNA microarray,）,分子杂交等技术可用来筛选重组克隆,用探针鉴定,DNA,称为,Southern,印迹,鉴定,RNA,称,为,Northern,印迹,Southern-blot,印迹杂交原理示意图,染色体的原位杂交,基因芯片的应于,发育生物学研究,在基础研究和应用领域具有广泛用途的,DNA,芯片,同一物种不同生态型之间,DNA,多态性产生的,RFLP,DNA,指纹,（,DNA fingerprint,）,DNA,指纹分析应用于刑侦,1.5.9.Marker,，,8.10,都是对照,2.,嫌疑人,A,血细胞,DNA,3.,被害人衣服上残留精液,DNA,4.,嫌疑人,B,血细胞,DNA,6.,被害人阴道取样,DNA,7.,被害人血,DNA,8.,实验对照,从上世纪,90,年代初开始，用了,10,年时间，人类完成了,对自身染色体的,30,亿对碱基的序列测定，这就是所谓,的,人类基因组项目（,HGP,）,在人类基因组项目基本完成之后，,人类蛋白质组项目,将要展开，旨在对人类基因组表达的全部蛋白质进行全面的、高通量的、精细的分析，这是后基因组时代的新的研究领域，对于人类认识自己，控制疾病的意义将难以估量。,3.,核酸技术的应用,在生命科学研究中的应用,在动物疾病诊断中的应用,在动物遗传育种中的应用,在生物制药中的应用,在农业中的应用,动物生物化学练习（,3,）,1.,氨基酸参与了动物体内一些重要含,N,小分子的合成。请指出以下,3,种物质的主要功能，它们各由哪些氨基酸为原料转变而成。,a.,肾上腺素；,b.,磷酸肌酸；,c.,嘧啶,2.DNA,的复制包括哪些主要阶段？为什么复制具有半保留性？为什么说子链的合成是半不连续的？,3.,转录的终止出现在,DNA,分子中特定的碱基顺序上。原核,DNA,转录的终止顺序有明显的结构特点，请予描述。除此以外，还有什么其它的终止转录的方式？,4.,关于蛋白质多肽链的翻译过程，请你,a.,说明氨基酰,-tRNA,合成酶的特点；,b.,图示原核,70S,起始复合物；,c.,解释延伸因子,Tu,的作用；,d.,指出何时肽酰基转移酶起作用。,5.,简述肾上腺素通过,cAMP/PKA,途径中酶的级联放大效应催化肌肉糖原分解的生物化学原理。,