菌落总数与大肠菌群数测定.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,菌落总数与大肠菌群数测定,1,主要内容,菌落总数测定,大肠菌群测定,MPN法原理（拓展内容）,2,菌落总数测定,掌握菌落总数测定方法,实验原理,不同稀释度的样品，营养琼脂培养基，,36,，,48h,（水产品,30,，,72h,），菌落数,3,菌落总数测定,器材与试剂：,样品，无菌生理盐水，平板计数琼脂培养基，,1ml,吸管，培养皿,4,菌落总数测定,5,倾注培养,6,培养结果,7,菌落总数测定,实验步骤,5.,菌落计数：,肉眼观察，可用放大镜，可标记,必要时分区计数，菌落成片者作废,计算方法,某稀释度的菌落数：两平板菌落数取平均值,选择菌落数在,30-300,之间的稀释度,（,1,）仅有一个稀释度在此范围：,菌落数,稀释倍数,8,菌落总数测定,计算方法：,（,2,）有两个稀释度在,30-300,之间,菌落数之比,2,，选较小值,菌落数之比,300,取稀释倍数最大者,（,4,）所有稀释度均,30,取稀释倍数最小者,（,5,）没有任何稀释度在,30-300,之间,选最接近该范围者,结果单位：,CFU/ml,（,g,）,9,菌落总数测定,注意事项：,1.,无菌操作,2.,标记,3.,何时更换吸管,4.,吸吹混匀,5.,琼脂培养基保温,6.,安全常识,10,大肠菌群数测定,实验目的,实验原理,36,，,48h,，产气（小倒管）,三步法：初发酵、复发酵,器材与试剂,样品、无菌生理盐水、,LST,肉汤，,BGLB,肉汤,1ml,吸管、,10ml,吸管、试管、小倒管,11,初发酵,器材与试剂,样品、,225ml,无菌生理盐水、,9ml,无菌生理盐水、双料,LST,肉汤，单料,LST,肉汤，,10ml,吸管、,1ml,吸管、吸球,12,大肠菌群数测定,实验步骤：,1.,初发酵,13,14,15,吸取样品方法,16,加注样品,17,初发酵结果,右边为阳性结果，小倒管内有气体产生。,18,实验步骤,3.,复发酵,（,1,）选取产气试管,（,2,）接种至,10mlBGLB,肉汤中,（,3,）培养：,36,，,48h,（,4,）观察指标：若产气则报告大肠菌群阳性。,19,大肠菌群数测定,实验步骤,2.,分离培养,（,1,）制备伊红美蓝平板：,45,，无菌，倾注，,15ml,（,2,）选产酸产气的发酵管,（,3,）接种至伊红美蓝平板,分区划线法,（,4,）培养：,36,，,48h,20,分离培养,器材与试剂,初发酵结果（,4,只发酵管）、酒精灯、接种环、伊红美兰平板培养基,21,分区划线法,第一区划线,灭菌接种环,第二区划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,22,分区划线法,操作要点,1.,划下一个区前必须灭菌接种环,2.,划线时接种环同平板呈,30-40,角,3.,每次划线应该压到上一个区域的,2-3,条线,4.,用接种环的“面”而不是“弧”在平板上滑动,23,大肠菌群数测定,实验步骤,2.,分离培养：,（,5,）菌落特征：,深紫黑色、有金属光泽,紫黑色、无或略有金属光泽,淡紫红色、中心颜色深,（,6,）革兰染色、镜检：选特征菌落,24,革兰染色法,器材与试剂,结晶紫、卢戈碘液、,95%,乙醇、酸性复红、生理盐水、酒精灯、载玻片、滤纸,25,革兰染色法,涂片：接种环，挑取菌落，,生理盐水一滴，涂匀,热固定：通过火焰若干次,初染：结晶紫一滴，,1min,，水洗,媒染：卢戈碘液一滴，,1min,，水洗,脱色：,95%,乙醇，,30s,或至无色为止,复染：复红一滴，,30s,26,涂片,27,热固定,28,初染,29,媒染,30,脱色,31,复染,32,革兰氏染色阴性,革兰氏染色阳性,革兰染色法,33,复发酵,器材与试剂,培养,24,小时后的伊红美兰平板、酒精灯、接种环、复发酵管,34,大肠菌群数测定,实验步骤,3.,复发酵,（,1,）选取鉴定为无芽孢,G,-,杆菌的菌落,1-3,个,（,2,）接种至,10ml,乳糖蛋白胨培养液,（,3,）培养：,37,，,24h,（,4,）观察指标：产酸，产气,35,液体接种,36,复发酵,复发酵阳性结果，培养基变成黄色，小倒管内有气体产生,37,大肠菌群数测定,注意事项：,1.,无菌操作,2.,吸管使用,3.,洗去染液的方法,4.,显微镜保养,5.,液体接种,38,MPN法原理,MPN法（Most Probable Number Method）,目的：对某种细菌进行选择性计数,核心思想：泊松分布,实施方法：多次稀释直至无菌，每个稀释度分别接种若干培养管，根据阳性管数估算MPN值,39,MPN法原理,MPN,法（,Most Probable Number Method,）,1.,细菌进入发酵管的概率近似服从泊松分布,:P(x=k)=e,-x,x,k,/k!,x:,细菌浓度，,k:,进入发酵管的细菌数,2.,若在,n,管发酵中，令接种水样量为,Vi,，阳性管数为,Pi,，阴性管数为,Qi,，则该检验结果发生的概率为：,其中,C,为常系数,V,为总水样量，,x,为细菌个数,40,MPN法原理,3.,当,y(x),max,，,XMPN,4.,由于,y(x),为单极值函数，令,dy/dx=0,即,5.,解此方程，得,x=MPN,6.,该方程为超越方程，一般采用数值法求近似解,7.,日常实验时采用查表法推算,MPN,值。,8.,表格在教材第,260-261,页。,41,谢谢！,42,