实验一大肠杆菌的培养和分离.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2018-03-05,#,试验1 大肠杆菌的培养和分离,大肠杆菌,革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人体无害，但也有某些菌株是对人体有害的，可以侵袭肠粘膜并产生毒素。不过，任何大肠杆菌假如进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。大肠杆菌也是基因工程技术中被广泛采用的工具。它以分裂方式繁殖，分裂速度较快。,革兰氏染色：是一种通过对细菌进行染色从而到达鉴别细菌的措施。根据的原理是细菌的细胞壁构造不一样，据此可以分为两种：革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。染色成果：革兰氏阳性菌染色后用酒精脱色不变色，复染后呈紫色；革兰氏阴性菌染色后用酒精脱色会变色，复染后呈红色。,兼性厌氧：既可以在有氧条件下进行新陈代谢，又可以在无氧状态下进行新陈代谢。但在这两种状况下，体内的生化反应是不一样的，也就是说产能途径不一样。,单菌落的分离是消除污染杂菌的通用措施，也是用于筛选高体现量菌株的最简便措施之一。,培养皿涂布杂菌形成的菌落,（一）菌落,划线法,形成,的菌落,（二）培养基,由人工措施配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,LB,（,Luria-Bertani,）液体培养基,：蛋白胨,10g/L,，酵母提取液,5g/L,，氯化钠,10g/L,。,配制,50mL,的,LB,培养基：蛋白胨,0.5g,，酵母提取物,0.25g,，氯化钠,0.5g,，加,50mL,水溶解。,LB,（,Luria-Bertani,）固体培养基,：,50ml LB,（,Luria-Bertani,）液体培养基中再加入,1g,琼脂制得,。,固体培养基可根据需求制成平面或斜面。,（可用于大肠杆菌的扩大培养）,（可用于大肠杆菌的划线分离）,通用的细菌培养基：,细菌培养基需求中性偏碱，霉菌培养基需求中性偏酸。,LB,液体培养基：,细菌在液体培养基中,扩大培养,LB,固体培养基,倒入,平板,，用于分离细菌,制成斜面，用于保留,细菌,划线分离,涂布分离,单菌落更易分开,操作简朴,操作复杂,（,三,),细菌的分离,（三）无菌技术,泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的措施。,1,、,消毒：,是指杀灭大部分病原微生物的措施。,（,1,）,100,煮沸,5-6min,（,2,）巴氏消毒法：,70-75,下煮,30min,或,80,下煮,15min,（,3,）用,75%,酒精等进行皮肤消毒,（,4,）紫外线消毒,常用消毒措施：,（,1,）,灼烧灭菌,2,、灭菌：,是指杀灭或清除环境中一切微生物（包括芽胞、孢子）的措施。,（,2,）,干热灭菌：,160-170,下加热,1-2h,。,（,3,）,高压蒸气灭菌：,100kPa,、,121,下维持,15-30min.,针对不一样的试验器材或材料选择不一样的灭菌方式：,多种器皿（如培养皿、三角瓶、取样器的头等）：高压蒸汽灭菌法,灭菌后放入60-80的烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分。在进行试验前，需将要使用的器具从烘箱中取出，放在超净工作台上，打开紫外灯和过滤风，灭菌30min。,培养基：一般 121灭菌15min,有葡萄糖：500g/cm2（90以上）灭菌30min,有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）,进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。,大肠杆菌的培养和分离试验操作环节,试验器材,培养基,（微生物生存的环境和营养物质）,LB,液体培养基,大肠杆菌菌种斜面,空白斜面,（一）培养基的制备与灭菌,取两个,250ml,的三角瓶，分别装入,50ml LB,液体培养基和,50ml LB,固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，用牛皮纸包装后放入灭菌锅内，,1kg,压力灭菌,15min,。,LB,液体培养基,细菌的扩大培养,LB,固体培养基,细菌的划线分离,（二）倒平板,待灭菌后的固体培养基冷却到60时，在超净台上分别将培养基倒入4个培养皿中，每倒入一种培养皿后立即将培养皿置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝固后形成平面。,无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒,操作时右手无名指和小指夹住封口膜，此外三指持三角瓶，左手拿培养皿并打开上盖的一边，在酒精灯火焰旁操作。,（三）大肠杆菌的接种,将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到,灭菌后的,LB,液体培养基,中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。,注意事项,:,1.,在,火焰旁,从斜面上用接种环取菌,;,2.,取菌前,接种环要,用酒精灯,灼烧,灭菌，冷却后方能取菌,；,3.,接种时右手拿着接种环，右手无名指和小指,夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜,；,4.,取菌后封口膜和棉塞复原,.,三角瓶在,37,，每分钟,200,转的摇床上振荡培养,12h,。,（四）大肠杆菌的扩大培养,（五）大肠杆菌的划线分离,1、操作环节,（1）灼烧接种环；,（2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液；,（3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。,划线分离、培养、菌种保留,划线后盖好培养皿，将培养皿倒置,在,37,恒温培养箱中培养,12-24h,划线的末端出现不持续的单个菌落，表明菌已被分离。,在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 培养24h后，置于4 冰箱中保留。,1、划线分离法,2,、问题讨论,（3）为何每次划线之前都要灼烧接种环？,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增长，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。,（1）在灼烧接种环之后，为何要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,（2）划线操作时，为何总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目伴随划线次数的增长而逐渐减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,课堂小结与作业布置,即时反馈,2、涂布分离法,2、涂布分离法,在合适的稀释浓度下，,可以培养到互相分开的单菌落,Q,：使用过的器皿、培养基等能否直接丢弃？,养成良好的试验操作习惯，不要让造福人类的前沿科技变成生物污染！,have a try!,2,、大肠杆菌扩大培养时，常用的培养基是（）,A,、,LB,液体培养基,B,、,LB,固体培养基,C,、,LB,斜面培养基,D,、,LB,平板培养基,1、与液体培养基相比，固体培养基增长的成分是（）,A、氯化钠 B、琼脂,C、酵母提取液 D、蛋白胨,A,B,3,、在平板划线操作中，错误的是,(,),A将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红,B将烧红的接种环在火焰旁边冷却,C接种环在平板上的划线位置是随机的,D在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰,C,