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猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立

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2020年4月19日
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猪圆环病毒引起的断奶后多系统衰竭综合征诊断方法标准的建立
Diagnostic methods of porcine postweaning multisystemic wasting syndrome
崔尚金*,李曦,符芳,曲连东，童光志
（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 疫病诊断与流行病学中心 哈尔滨 150001）

前言
猪断乳后多系统衰竭综合征（PMWS）是一种由猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）引起的新病。猪圆环病毒(PCV)是1974年在猪肾传代细胞系 PK-15中发现的一种污染病毒，该病毒不产生细胞病变效应（CPE），无致病性，命名为PCV1；而后在猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)中分离的猪圆环病毒，有致病性，命名为PCV2。PMWS主要感染1-5月龄猪，发病率为4-30%，致死率为70-80%。断乳猪和生长猪临床表现为进行性消瘦、呼吸困难、皮肤苍白、黄疸、腹泻和体表淋巴结肿大。多种组织发生广泛的肉芽肿性炎症，肉芽肿性淋巴结炎、间质性肺炎、肝炎、间质性肾炎和胰腺炎。病理组织学变化主要是淋巴细胞组织不同程度的衰竭萎缩，淋巴细胞减少。世界许多养猪国家都发生了本病，中国也有本病流行。PMWS严重影响猪的生长发育，但对其发病机理，传染源等问题还不完全清楚， 本病没有有效的治疗方法，抗生素对PMWS患猪无效。但抗生素的使用和良好的饲养管理，有助于控制二重感染。当前还没有疫苗可供应用。

1 范围
本标准规定了猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的诊断方法。
本标准适用于猪断奶后多系统衰竭综合征的诊断。
2 诊断方法的种类和选用
确诊PMWS需要三个条件：存在相应的临床症状，特征性病理变化，从病灶中检出PCV2病原。根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，确诊必须依靠实验室检查。当前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、间接免疫荧光试验（IFA）、间接酶联免疫吸附试验（IELISA）、免疫组织化学试验（IHC）等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。PCR方法用于检测PCV病毒的核酸，应用型特异性引物可对PCV1和PCV2定型。IFA、间接ELISA方法主要用于检测PCV病毒抗体。IHC方法主要用于检测PCV病毒抗原，并进行病毒的组织学定位。
本标准指定上述五种实验室诊断技术为中国生猪PMWS的诊断方法，保证了中国对PMWS的诊断与国外的一
致性。在实际应用时，可根据需要和条件，从中选用1-2种方法即可。
3 临床症状和病理变化
3.1 临床症状
根据以下主要的临床症状可作出初步临床诊断:最常见的、也是确诊PMWS所必须的临床症状是衰竭和生长发育不良, 进行性消瘦；其它症状如精神不振、食欲不佳、被毛粗乱，消化不良、肌肉衰弱无力、腹泻、皮肤苍白、黄疸，还有咳嗽、喷嚏、呼吸困难等呼吸系统症状。体表淋巴结，特别是腹股沟淋巴结肿大。其它不常见的症状有发热、嗜睡、胃溃疡、中枢神经紊乱、猝死。这些临床症状不会同时在同一头猪上出现。发病猪场在一段时间内会出现大多数症状。一些临床症状由于继发感染或双重感染而恶化。
3.2 病理变化
3.2.1 剖检变化
最显著的病变是全身淋巴结，特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、气管、支气管淋巴结及下颌淋巴结肿大到2－5倍，有时可达10倍。在PMWS感染猪也观察到正常或萎缩的淋巴结。切面硬度增大，均匀的苍白色，集合淋巴小结也肿大。发生细菌感染，则淋巴结可见炎症和化脓病变，使病变复杂化。
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作者简介：崔尚金：博士，副研究员，当前主要从事动物疫病诊断、流行病学、地理信息系统GIS和外来病的研究工作.
*通讯作者，E-mail: ;
肺肿胀不崩陷，有散在，大而隆起橡皮状硬块。严重的病例，肺泡出血，部分病例尖叶和心叶萎缩或固质化。
脾中度肿大，呈肉变。
半数病例肝脏无明显异常，其它病猪表现不同程度的虎斑状外观，并伴有轻度或中度萎缩，有的病例肝肿大。
肾脏水肿，苍白，被膜下有白色坏死灶，盲肠和结肠粘膜充血或瘀血。
许多PMWS感染猪有支气管肺炎和胃溃疡，但胃溃疡和PCV2感染无直接关系，胃溃疡发生是多原因的。支气管肺炎与细菌感染有关，然而胃内病灶引起内出血，导致部分PMWS猪死亡的原因，也是导致皮肤苍白的原因。
3.2.2 组织学变化
淋巴结的皮质及副皮质区显著扩张，有单核/巨噬细胞，组织细胞浸润，有时还散布着大量的多核巨细胞。淋巴细胞减少，淋巴结基质常增生或有嗜酸性细胞浸润。淋巴滤泡有由组织细胞、类上皮细胞、巨噬细胞、多核巨细胞、嗜酸性白细胞、淋巴细胞集聚形成的肉芽肿。其它组织有广泛的淋巴细胞、单核细胞、组织细胞浸润。
4 病毒的分离与鉴定
4.1 材料准备
4.1.1 器材： 25cm2（T25）细胞培养瓶、直径15mm盖玻片、55mm圆形有盖平皿、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳（CO2）恒温箱、普通冰箱及低温冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2μm的微孔滤膜、普通光学显微镜。
4.1.2 试剂：RPMI1640营养液、犊牛血清、青霉素（105ug/mL）与链毒素（105ug/mL）溶液、氯仿、300mM D（+）氨基葡萄糖、Hanks平衡盐溶液。
4.1.3细胞培养物：无PCV污染的猪肾传代细胞PK-15。
4.1.4样品
4.1.4.1 样品的采取和送检：在发病早期，无菌采取病猪的血清。对病死猪立即采取肺、扁桃体、淋巴结、脾、肾、肝等组织数小块，置冰瓶内立即送检。不能立即检查者，应放-25℃～-30℃冰箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。
4.1.4.2 样品的处理：若样品经PCR检测为PCV阳性，按如下方法进行处理。血清可直接使用。肺、淋巴结、扁桃体、脾、肾、肝等组织混合，组织剪碎后研磨成糊状，加入含有105ug/ml链霉素，105ug/ml青霉素，两性霉素B 200ug/ml的RPMI1640营养液，制成10%（W/V）悬液，-20℃重复冻融3次或-70℃冻融1次， g离心30min。吸取上清液，转移到新的离心管中，每1ml上清加入50ul氯仿，室温下不断混合10 min，1000g离心10 min。怀疑有细菌污染的样品，也可用0.2μm微孔滤膜过滤处理。取上清，注意避免吸出氯仿，分装，-70℃保存。
4.2 操作方法
4.2.1 接种样品：取2ml上清液加到18 ml PK-15细胞悬液，细胞浓度达到5×104个/ml，培养液用10%犊牛血清和1%双抗的RPMI1640。将12ml病毒细胞混合悬液分装到2个25cm2（T25）通气的细胞培养瓶中，每瓶6ml。6ml加入到装有直径15mm盖玻片的55mm圆形有盖平皿中，置于37℃ 5% CO2培养箱。
4.2.2 细胞处理：接种后18-24h长成50-60%单层细胞， 倾去培养瓶中培养液，加入2-3ml预热300 mM D（+）氨基葡萄糖，能覆盖细胞足以，放入37℃培养箱继续作用30min。去除氨基葡萄糖，以Hanks平衡盐溶液冲洗2-3次，加入含有2%血清的维持液，放回培养箱。
4.2.3 继续培养48h后，用间接免疫荧光法对平皿中的玻片培养物进行染色，以监控病毒生长。
4.2.4 重复感染：取1个T25瓶重复冻融3次。用胰酶消化另一个T25瓶内细胞，悬于21ml生长液，再加入第一瓶中的细胞悬液6ml，取15ml 接到一个75cm2(T75)瓶，6ml接到一个T25瓶，6ml接种到有盖玻片的平皿中。
4.2.5 72-96h后取平皿中玻片进行免疫荧光染色，观察病毒的生长情况。将T25瓶重复冻融3次，接种到T75瓶内，继续传代。取少量细胞悬液进行PCR的检测。
4.3 结果的判断和解释
在第一代培养时，若IFA检测为阴性应继续盲传，第三代培养IFA、PCR检测为阳性，则判定为PCV病毒分离阳性。
5 聚合酶链式反应（PCR）
5.1 材料准备
5.1.1 器材：微量移液器、吸头、离心机、研磨器、PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、恒温干燥箱等。
5.1.2 试剂： Tris饱和酚、氯仿、10%SDS、50ug/ml 蛋白酶K、无水乙醇或异丙醇、3 MpH5.2醋酸钠、75%乙醇；Taq DNA聚合酶、dNTP(2.5mmol/l)、10×Buffer、灭菌去离子水、特异性引物、标准DNA分子量的Marker、上样缓冲液。
5.2 病毒DNA的提取：
5.2.1 样品的处理：取发病猪脾、淋巴结、肝、肾等脏器剪碎加入适量生理盐水研磨制成组织匀浆，重复冻融3次，3000g离心20min，吸取上清用于提取DNA 。发病猪的全血和血清可直接进行检测。
5.2.2 核酸提取：
5.2.2.1 取500ul组织冻融上清、全血或血清加入25ul 10% SDS，5ul蛋白酶K，振荡混合数次，置37-56℃水浴锅中2-3小时，其间振荡混合几次。
5.2.2.2 酚抽提：每管中加入200ul酚，颠倒混合30s,1 rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管。
5.2.2.3 酚/氯仿抽提：每管分别加入100ul和100ul氯仿，颠倒混合30s,1 rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。
5.2.2.4 氯仿抽提：每管分别加入200ul氯仿，颠倒混合30s,1 rpm离心10min。吸出上层水相，转移到新管，并作好标记。
5.2.2.5 每管中加入2.5倍无水乙醇，1/10体积的3M pH5.2 NaAc（醋酸钠），混合数次，-20℃沉淀2h或过夜。或每管中加入等体积的异丙醇，1/10体积的3M pH 5.2 NaAc（醋酸钠），混合数次，室温下沉淀20-30min。
5.2.2.6 13000rpm离心10-15min,倒掉管内液体，在滤纸上吸干，不要求完全干燥。
5.2.2.7 每管中加入100-200ul 70%的乙醇,1 rpm离心5min。倒掉管内液体,在滤纸上吸干，放入37℃温箱烘干。
5.2.2.8 20-40ul 灭菌水溶解沉淀，重复吹打沉淀，促进沉淀溶解。
5.2.3 PCR扩增：PCR反应液应在冰上配制，配液顺序：灭菌水，10×buffer，dNTP，引物，Taq酶，样品DNA。
5.2.3.1 50ul 的反应体系：
Taq (5U/ul)： 0.4-0.5ul
10×buffer： 5ul
dNTP(2.5mM)： 4ul
引物1（10pmol/ul）： 2ul
引物2（10pmol/ul）： 2ul
灭菌水： up to 50ul
模板DNA： 5ul
5.2.3.2 PCV病毒特异性引物序列：能扩增PCV1和PCV2，扩增片段938bp。P1：5'- gTCTTCTTCTgCggTAACgCCTCCTTg -3'，P2：5'- TAggAggCTTCTACAgCTgggACAg -3'；PCV2型特异性引物序列：扩增片段为490bp。P3：5'- ATTgTAgTCCTggTCgTATATACTgT -3'，P4：5'- CTCCCgCACCTTCggA -3'
5.2.3.3 PCR的反应条件：95℃ 5 min; 94℃ 1min, 52℃ 1min, 72℃ 1min ， 35个循环；72℃ 10min.
5.2.3.4 PCR电泳：取5ul PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。
5.2.4 结果判定与解释：PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，扩增出938bp和490bp的两条带为PCV2阳性。只扩增出938bp一条带为PCV1阳性。同时应设正常PK-15细胞DNA、水阴性对照，不能扩增出任何条带。PCV1阳性DNA的阳性对照可扩增938bp，PCV2阳性DNA的阳性对照可扩增938bp 和490bp的两条带。
6 间接免疫荧光试验（IFA）
6.1材料准备
6.1.1器材：荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。
6.1.2 试剂
6.1.2.1 IFA诊断板的制备：见附录。
6.1.2.2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄（FITC）结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。
6.1.3 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用PBS液作20倍稀释。
6.2 操作方法
6.2.1 取IFA诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加100μL PBS液洗一次，弃去PBS液并在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.2 在编号对应的孔内加入20倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔2个及其后感染细胞孔1个，每孔100ul，同时做标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用PBS液代替血清。置37℃恒温箱中感作45min。
6.2.3 弃去板中血清，用PBS液洗板3次，每孔100ul，每次5min，最后在吸水纸上轻轻拍干。
6.2.4 每孔加入工作浓度的兔抗猪FITC结合物50ul，在37℃恒温箱中感作45min。
6.3 荧光显微镜检查及判定与解释
荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板一般见BG12，吸收滤板用OG1或GG9），在5倍～10倍目镜下检查。标准阳性血清对照中感染细胞孔（P·V+）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（P·V-）不应出现特异性荧光；标准阴性血清对照、空白对照中感染细胞孔（N·V+）和未感染细胞孔（N·V-）均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔（C·V-）不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔（N·V+）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性。
7 间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）
7.1 材料准备
7.1.1 器材：96孔平底微量反应板、微量移液器、酶标测定仪、恒温箱、保湿盒等。
7.1.2 试剂
7.1.2.1 PCV病毒抗原和正常细胞对照抗原，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.3 PCV病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
7.1.2.4 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，依照附录A自行配制。
7.1.3 样品：采集被检猪血液分离血清，血清必须新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，4℃或-30℃冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作20倍稀释。
7.2 操作方法 参照图。

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
P
P
S3
S3

B
P
P
S3
S3

C
N
N
S4
S4

D
N
N
S4
S4

E
S1
S1
S5
S5

F
S1
S1
S5
S5

G
S2
S2
S6
S6

H
S2
S2
S6
S6

V
C
V
C
V
C
V
C
V
C
V
C
V-为PCV病毒抗原包被列；C-正常细胞抗原包被列；P-标准阳性血清对照孔；
N-标准阴性血清对照孔；S1、S2、S3等一被检血清编号。
图 间接ELISA诊断板加样示意图
7.2.1 包被抗原：取96孔平底微量反应，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工浓度的对照抗原，每孔100μL（参照图2），封板，置保湿盒内放37℃恒温箱中感作60min，再移置4℃冰箱内过夜。
7.2.2 洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔300μL，洗涤3次，每次2min，在吸水纸上轻轻拍干。
7.2.3 封闭：每孔加入封闭液100μL，封板后置保温盒内37℃恒温箱感作2h。
7.2.4 洗涤：方法同7.2.2
7.2.5 加血清：反应板按图2编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清。每份血清各加2个病毒抗原孔和2个对照抗原孔，孔位相邻。每孔加样量均为100μL。封板，置保湿盒内于37℃恒温箱中感作15min。
7.2.6 洗板：方法同7.2.2。
7.2.7 加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体100μL，封板，放保温盒内置37℃恒温箱中感作2h。
7.2.8 洗板：方法同7.2.2
7.2.9 加底物：每孔加入新配制的底物溶液100μL，封板，在37℃恒温箱中感作30min。
7.2.10 加终止液：每孔添加终止液100μL终止反应。
7.3 光密度（OD）值测定与计算
7.3.1 OD值测定：在酶标测定仪上用λ=490nm读取反应板各孔溶液的OD值，记入专用表格。
7.3.2 OD值计算
按下式分别计算标准阳性血清、标准阴性血清和被检血清与2个平行抗原孔反应的OD值的平均值。标准阳性血清（P）与病毒抗原（V）反应的均值P·V(OD490)按式（1）计算。标准阳性血清（P）与对照抗原（C）反应的均值P·C(OD490)按式（2）计算。标准阴性血清（N）与病毒抗原（V）V(OD490)按式（3）计算。被检血清（S）与病毒抗原（V）反应的均值S. V(OD490)按式(4)计算。被检血清(S)与对照抗原(C)反应的均值S. C(OD490)按式(5)计算。
P·V(OD490)=[A1（OD490）+B1（OD490）]/2……………………（1）
P·V(OD490)=[A2（OD490）+B2（OD490）]/2……………………（2）
N·V(OD490)=[C1（OD490）+D1（OD490）]/2……………………（3）
S·V(OD490)=[E1（OD490）+E1（OD490）]/2 (以S1血清为例)………………（4）
S·V(OD490)=[E1（OD490）+E1（OD490）]/2 (以S1血清为例)………………（5）
S/P=[S·V(OD490)-S·C(OD490)]/[P· V(OD490)-P·C (OD490)]……（6）
7.3.3 按式(6)计算被检血清OD值与标准阳性血清OD值的比值S/P。
7.4 结果的判定与解释
7.4.1 有效性判定：P·V (OD490)与N·V(OD490)的比值必须大于或等于1.5时,才可进行结果判定.否则,本次试验无效。
7.4.2 判定标准与解释
A) S/P比值小于0.4,判定为PCV病毒抗体阴性,记作间接ELISA(一).
B) S/P比值大于或等于0.4,小于1.5,判定为疑似,记作间接ELISA(±).
C) S/P比值大于或等于1.5, 判定为PCV病毒抗体阳性,记作间接ELISA(+).
间接ELISA(+)者表明被检猪血清中含有PCV病毒抗体.
8 免疫组织化学试验（IHC）
8.1 材料准备
8.1.1 器材：光学显微镜、湿盒、磁力搅拌器、恒温箱等。
8.1.2 试剂
8.1.2.1 PCV病毒抗原和正常细胞对照抗原，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前，按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度。
8.1.2.2 兔抗猪IgG辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由中国农科院哈尔滨兽医研究疫病诊断与流行病学中心所提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
8.1.2.3 PCV病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由中国农科院哈尔滨兽医研究所疫病诊断与流行病学中心提供。使用前说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。
8.1.2.4 PBS缓冲液（pH7.2～7.4），0.5mol/L EDTA缓冲液（pH 8.0），1mol/L的TBS缓冲液（pH 8.0）， 0.4%胃蛋白酶液，3%甲醇-H2O2溶液，封裱剂。
TBS/PBS pH9.0～9.5。标准兔抗PCV2特异性阳性血清，过氧化酶标记的羊抗兔二抗。抗原修复液：1mM的EDTA缓冲液（pH8.0），它适用于大多数需要抗原热修复的抗体。
8.1.2.5 样品：无菌采集被检猪组织，组织应新鲜、无污染，采后立即放入10%甲醛溶液中，或立即保存于-20℃。
8.2 操作方法
8.2.1组织块按常规方法制成石蜡切片。
8.2.2 石蜡切片经二甲苯瞬间脱蜡即可。切片先后浸入95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、40%乙醇水化；
8.2.3 浸入PBS洗3次各5分钟；
8.2.4 1-3% H2O2（80%甲醇配制）滴加在组织切片上，室温静置10分钟；
8.2.5 PBS洗3次各5分钟。
8.2.6 微波修复抗原；将片子放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95℃以上，并持续10-15分钟，室温20-30分钟自然晾凉，使蛋白复性。
8.2.7 PBS洗3次各5分钟；
8.2.8 滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8.2.9 滴加工作浓度的标准阳性血清50μl，同时设加PBS的对照，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
8.2.10 PBS洗3次各5分钟；10）滴加工作浓度的二抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时。
8.2.11 PBS洗3次各5分钟；
8.2.12 新配制的DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度。
8.2.13 PBS冲洗5分钟；蒸馏水冲洗。
8.2.14 苏木精复染1-2分钟，流水冲洗，
8.2.15 干燥后，无水酒精脱水5min,二甲苯透明5min，加拿大胶封片，镜检。
8.3 结果的判定与解释
若为PCV阳性，细胞浆内酶标抗体抗原复合物呈黄褐色，背景呈淡黄色或无色。 PBS对照的切片呈淡黄色或无色，无黄褐色。
9  综合判定
当在临床上怀疑有PMWS感染时，确诊PMWS必须符合以下三个条件：有相应的临床症状，特征性病理变化，从病灶中检出PCV2抗原或核酸。根据临床症状和病理变化只可作出初步诊断，猪群中普遍存在PCV2的抗体，单一的抗体阳性不能确诊为阳性。确诊必须依靠实验室方法检测出病毒的抗原或核酸。可根据实际情况，由上述五种方法中选用一种或两种方法进行确诊。
附录 试剂的配制
 A1 300mM D（+）氨基葡萄糖 用于病毒分离
用37℃预热蒸馏水溶解氨基葡萄糖，加入适当体积（10×）Hanks平衡盐溶液， 0.22um孔过滤。
A2 10%SDS 用于核酸的提取
100g SDS 加水到1000ml，加热到68℃助溶，浓盐酸调pH值到7.2。
A3 3mol/l 乙酸钠(pH 5.2) 用于核酸的提取
408.1 g乙酸钠加水到1000ml，用冰乙酸调pH 到5.2，高压灭菌。
A4 PBS液（0.01mol/L PBS, pH=7.2）用于IFA
氯化钠（NaCl） 8.5 g；
磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 2.5786 g
磷酸二氢钠（Na H2PO4.2 H2O） 0.4368 g；
去离子水加至 1000ml；
保存于4℃备用。
A5 封裱剂 用于IFA
甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
A6 洗涤液（0.01mol/L PBS-0.1% 吐温-20，PH=7.4）用于间接ELISA,现用现配。
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.89 g
氯化钠（NaCl） 8.0 g
氯化钾（KCl） 0.2 g
吐温-20 1ml
去离子水加至 1000ml

A7 抗原稀释液（0.05mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）用于间接ELISA
碳酸钠（Na2CO3） 1.59g
碳酸氢钠（NaHCO3） 2.93g
去离子水加至 1000ml
4℃保存，一周内用完。
A8 血清稀释液 用于ELISA
为含1%犊牛血清的“A4”液。
A9 封闭液 用于间接ELISA
为含1%牛血清白蛋白或10%马血清的“A4”液。
A10 底物溶液 用于间接ELISA
A10.1 0.1mol/L柠檬酸溶液
柠檬酸（C6H8O7） 1.92 g
加去离子水至 100mL
A10.2 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 7.16g
加去离子水至 100mL
A10.3 底物溶液（OPD-H2O2）
0.2 mol/L柠酸溶液 2.43 mL
0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液 2.57 mL
邻苯二胺（OPD） 4.0 mg
30%过氧化氢（H2O2） 0.015 mL
去离子水 5 mL
充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配。
A11 终止液 用于间接ELISA
2 M H2SO4
A12 PBS缓冲液（pH7.2～7.4：）用于IHC
磷酸二氢钾（KH2PO4） 0.2 g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 2.89 g
氯化钠（NaCl） 8.0 g
氯化钾（KCl） 0.2 g
A13 内源性酶抑制剂 用于IHC
30 % H2O2 1mL
1% NaN3 1mL
0.015mol/L pH7.4 PBS 100mL
 A14 0.05mol/L pH 7.6 Tris-HCl 缓冲液 用于IHC
0.2mol/L Tris 25ml
0.1 mol/L HCl 38.9ml
加去离子水到 100mL 。
A15 显色液（DAB- H2O2） 用于IHC
0.05mol/L pH 7.6 Tris-HCl 缓冲液 100 mL
3,3- 二胺基联苯胺盐酸盐 76 mg
1% H2O2 0.5 mL
B1 IFA诊断板的制备
用细胞分散液消化PK-15细胞，用细胞营养液稀释成5×104细胞/mL，加入PCV标准毒，使其最终浓度为100TCID50/25μL，加到96孔细胞培养板的1、2、4、5、7、8、10、11列各孔内，每孔100μL。在3、6、9、12列各孔内加入未感染病毒细胞悬液100μL。将该细胞培养板置37℃、5%二氧化碳培养箱中培养60h~68h。弃去培养液，每孔加入丙酮100μL，将此细胞培养板置于—20℃或—70℃冰箱中备用。