GB∕T 40249-2021 斑节对虾杆状病毒病诊断规程 PCR检测法.pdf

ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准GB/T 40249-2021 斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon-type baculovirus一PCR method 2021-05-21发布国家市场监督管理总局申+国家标准化管理委员会保W2021-12-01实施GB/T 40249-2021 目。吕本文件按照GB/T1.1-2020(标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出。本文件由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本文件起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站。本文件主要起草人:杨冰、万晓援、黄健、李清、史成银、张锋、宋晓玲、余卫忠、张庆利、李晨、刘莉、许华。I 1 范围斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法GB/T 40249-2021 本文件规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对斑节对虾杆状病毒CPeeusmonodon-type baculovirus, MBV) ，给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。本文件适用于对虾各生活期样品中MBV带毒情况的定性检测，以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/ T 28630.4-2012 臼斑综合征CWSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略i吾适用于本文件。bp:碱基对Cbase pair) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核昔三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate) EB:澳化乙院Cethidium bromide) EDTA:乙二胶四乙酸Cethylenediaminetetraacetic acid) HCl:盐酸Chydrogen chloride) MBV:斑节对虾杆状病毒CPenaeusmonodon-type baculovirus) NaOH:氢氧化铀(sodium hydroxide) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechain reaction) SDS:十二烧基硫酸(sodiumdodecyl sulfate) Taq:水生栖热菌(thermusaquaticus) T E : Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTATris日Cl)Tris:三起甲基氨基甲皖Ctris hydroxymethyl aminomethane) GB/T 40249-2021 5 试剂或材料5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。5.2 元水乙醇。5.3 TE缓冲液:按附录A中A.3配制。5.4 抽提缓冲液:按A.6配制。5.5 蛋白酶K:按A.7配制。5.6 10 mol/L乙酸镀:按A.8配制。5.7 Tirs饱和盼(pH注7.8)。5.8 酣/氯仿/异戊醇(25: 24 : 1)。5.9 氯仿/异戊醇(24: 1)。5.10 1 X电泳缓冲液:按A.10配制。5.11 70%乙醇:按A.11配制。5.12 dNTPs(各2.5mmol/L):生化试剂，含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物，20 oc保存，用于PCR。5.13 10XPCR缓冲液:生化试剂，无Mg2十离子，-20oc保存。5.14 MgC12 (25 mmol/L):生化试剂，-20oc保存。5.15 Taq DNA聚合酶(5U/f-1L):生化试剂，-20oc保存。5.16 引物261F(lOmol/L) : 5 -AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3 , ,-20 oc保存。5.17 引物261R(lOf-1mol/L) :5-CGT-TCG-TTG-ATG-AAC-ATC-TC-3, -20 oc保存。5.18 内参引物CF(10mol/L): 5 -TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3 , ,-20 oc保存。5.19 内参引物CR(lOmol/L): 5-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3 ，一200C保存。5.20 PCR检测阳性对照:为已知受MBV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织样品，-80oC保存。5.21 PCR检测阴性对照:为已知未受MBV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织样品，-80oC保存。5.22 PCR检测空白对照:灭菌双蒸水。5.23 琼脂糖:生化试剂。5.24 DNA分子量标准:生化试剂。5.25 6 X载样缓冲液:生化试剂。5.26 10 mg/mL EB贮存液:按A.12配制，或其他等效产品。6 仪器设备6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 2 PCR仪。电泳仪。水平电泳槽。紫外观察仪或凝胶成像仪。高速离心机。水浴锅或金属浴。普通冰箱。-80oC超低泪冰箱。电炉或微波炉等其他加热设备。微量移液器:量程0.5L10L、2L20L、20L200L、100Ll000L。GB/T 40249-2021 7 样晶7.1 采样对象斑节对虾(Peneusmonodo)等易感对虾。参见附录B。7.2 采样数量、方法和保存运输采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.4-2012中附录B的要求。7.3 样品的采集7.3.1 对虾仔虾取完整个体;幼虾、成虾和亲虾取肝膜腺和肠道;亲虾的非致死性取样可采集粪便。7.3.2 分子生物学检测时，仔虾或未达到0.5g样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测。所取样品分别置于1.5mL离心管中，立即进行DNA提取操作或暂时保存于20 oC。8 试验步骤8.1 DNA的提取8.1.1 取30mg50 mg组织样品，加人抽提缓冲液500L，充分研磨，37oC温浴1h。提取过程同时设置阳性对照和阴性对照。8.1.2 加入2.5L20 mg/mL蛋白酶K，至终浓度100g/mL，混匀后置于50oC水浴3h，不时旋动。8.1.3 将溶液冷却至室温，加人等体积平衡盼，颠倒混合10min，于10000 r/min离心3min分离两相。8.1.4 水相移至新1.5mL离心管中，加人等体积酣/氯仿/异戊醇(2524 : 1)，颠倒混合10min，于10 000 r/min离心mm分离两相。8.1.5 水相移至一新1.5mL离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1)，颠倒混合10min，于10000 r/min 离心1min分离两相。8.1.6 水相移至一新1.5mL离心管中，加入100L10 mol/L乙酸钱，混匀后，再加人两倍体积预冷无水乙醇(-20 oC)氓匀，一20oC放置2ho 10 000 r/min离心10min，弃上清。8.1.7 用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000 r/min离心5min，小心弃掉上清，将沉淀于室温晾干。8.1.8 加入100!lL灭菌双蒸水溶解DNA。8.1.9 若DNA样品需要保存，可溶解于100LTE缓冲液中并保存于一20oC。8.1.10 可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2 PCR扩增8.2.1 PCR反应体系:按照表1的要求，加入除T叫DNA聚合酶以外的各项试剂，配制成大体积的预氓物，分装保存于20 oC 0 11伍用前，加入相应体积的TaqDNA聚合酶，混匀，按1个反应体系/支分装到0.2mL PCR管中。分别加人各样品的模板DNA(质量浓度:50 ng/ !lL 100吨/L)1L，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。8.2.2 将上述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增:94 oC预变性5min; 94 oC变性30s、600C退火30s、720C延伸30s, 35个循环;72oC延伸7min;4 oC保温。GB/T 40249-2021 表1MBV PCR反应预混物所需试剂组成试剂2 5L体系试剂终浓度10 X PCR缓冲液(无Mg2+) 2.5L 1X PCR缓冲液试剂25L体系试剂终浓度MgCIz (25 mmol/U 1.5 f1.L 1.5 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/ U 2.0L 200mol/L 引物261F(lOmol/U0.75L 0.3 f1.mol/L 引物261R(lOmol/U0.75L 0.3mol/L 灭菌双蒸水16.4L Taq DNA聚合酶(5U/U 0.1L 0.02 U/L 注25L体系的模板量为1L。8.2.3 每份样品均设立十足目生物内参对照，扩增十足目生物组织DNA的PCR反应体系按照表2的要求。分别加入各样品的模板DNA(质量浓度:50 ng/ fJ.L 100 ng/L)lL。表2扩增十足目生物组织DNAPCR反应体系试剂组成试剂25L体系试剂终浓度10X PCR缓冲液(无Mg2+) 2.5L 1XPCR缓冲液MgC12 (25 mmol/U 1.5L 1.5 mmol/ L dNTPs(各2.5mmol/U 2.0L 200 f1.mol/L 内参引物CF(lOf1.mol/U 2.5L 1mol/L 内参引物CR(lOmol/U2.5L 1 f1.mol/L 灭菌双蒸水12.9L Taq DNA聚合酶(5U/f1.U 0.1 f1.L 0.02 U/L 注25L体系的模板量为1L。8.2.4 将土述加有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增:94 oc预变性3min; 94 oc变性1min 、55 oc退火1min、72oc延伸1min，35个循环;72 oc延伸5min;4 oc保温。8.3 琼脂糖;疑胶电泳及测序8.3.1 配制l.5%的琼脂糖凝胶，加入10mg/mL EB至终浓度0. 5g/mL，摇匀。制备琼脂糖凝胶。8.3.2 将5LPCR反应产物与1L6X载样缓冲液混匀后加入到加样孔中。同时设立DNA分子量标准对照。8.3.3 在1V /cm5 V /cm的电压下电泳，使DNA由负极向正极移动o当载样缓冲液中的澳四分蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/22/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照。8.3.4 如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。4 GB/T 40249-2021 9 结果判定9.1 检测结果成立条件十足目生物组织样品在848bp处有特定条带，阳性对照在261bp处有特定条带，阴性对照在261 bp处无条带且空白对照不出现任何条带，试验有效。9.2 检测结果判定检测样品在261bp处有条带，测序结果同参考序列(参见附录。进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性;检测样品在261bp处无条带可判为PCR结果阴性。GB/T 40249-2021 附录A(规范性)试剂配方A.1 1 mol/L Tris HCI(pH8.0) Tris 水121.1 g 800 mL 溶解后加入约42mL浓盐酸调pH接近8.0，冷却至室温，再用2.5mol/L HCl调整pH至8.0。加水定容至1 000 mL 分装后，高压蒸气灭菌，室温贮存。A.2 0.5 moI/L EDTA(pH8.0) 乙二胶囚乙酸二铀(EDTA-Na2 2H20) 18.6 g 水80mL 磁力搅拌，用2.5mol/L NaOH调节溶液pH值至8.0，完全溶解，定容至100mL。高压蒸气灭菌，室温贮存。A.3 TE缓冲液(pH8.0)1 mol/L Tris HCl(pH8.0) 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 加水定容至高压蒸气灭菌，4oc贮存。A.4 1 mg/mL膜RNA酶膜RNA酶TE缓冲液(pH8.0)10 mL 2 mL 1 000 mL 10 mg 10 mL 溶解后，于100oc加热15mi口，缓慢冷却至室温，分装100L/管，-20oc贮存。A.5 10% SDS SDS 水10 g 90 mL 加热至68oc助榕，加人几滴浓盐酸调节榕液的pH值至7.2，加水定容至100mL。室温贮存。若溶液有结晶形成，用前加热融解即可。SDS微细品粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平上的SDS。A.6 抽提缓冲液6 1 mol/L Tris HCl(pH8.0) 0.5 mol/L EDTA(pH8.0) 1 mg/mL膜RNA酶10% SDS 1 mL 20 mL 2 mL 5 mL 加水定容至1昆匀，室温贮存。100 mL A.7 20 mg/mL蛋白酶K蛋白酶K水20 mg 1 mL 溶解后分装于1.5mL离心管中(0.25mL/管)，一20oc下保存。A.8 10 mol/L乙酸按乙酸钱水TL gm 咛inu牛i门J加水定容至100mL，经0.45m滤膜过滤除菌，40C贮存。A.9 50 x电泳缓冲液Tris 242 g 57.1 mL 100 mL 1 000 mL 冰乙酸。.5mol/L EDTA(pH8.0) 加水定容至室温贮存。A.10 1 x电泳缓冲液50X电泳缓冲液加水定容至室温贮存。20 mL 1 000 mL A.11 70%乙醇无水乙醇加水30mL，混匀，定容至分装后，室温贮存。70 mL 100 mL A.12 10 mg/mL EB贮存液EB 水10 mg 1 mL 磁力搅拌数小时以确保其完全洛解。室温保存于棕色瓶或用铝铅包裹的瓶中。GB/T 40249-2021 7 GB/T 40249-2021 附录B(资料性)斑节对虾杆状病毒病简介斑节对虾杆状病毒病(In时lfec由tlOnwith Penae盯Z7n01wdo仰71-t印yp阳eb】acul扣ov山(M但BV)感染引起。国际病毒分类委员会CICTV)将该病毒名称暂定为斑节对虾单核多角体病毒CPemoNPV) ，但在多数情况下该病原被称为MBV，为核多角体病毒属成员。核酸类型为双链DNA。该病毒可感染对虾属CPeaeus)、明对虾属CFenero户enaeus)、囊对虾属CMeta户enaeus)和沟对虾属CMelicertus)等多种对虾。除卵和无节幼体，其余各生长阶段均易感染，且通常存在持续性感染。严重感染MBV的野生雌性斑节对虾产卵时，会排出含MBV的粪便，从而污染虾卵，将病毒传给下一代。MBV在东亚、东南亚、印度次大陆、中东、澳大利亚、印度尼西亚、新喀里多尼亚、东非和马达加斯加均有分布，但在斑节对虾自然地理分布范围以外的野生对虾群体中未发现。MBV经肠道感染肝膜腺小管和中肠前段站膜上皮细胞。受感染病虾在肝膜腺和中肠腺上皮细胞内，出现大量的核型多角体型包涵体或在粪便中有游离的多角体型包涵体。严重感染MBV的蚤状幼体、糠虾幼体和早期仔虾的中肠发自(这是由于在粪便中出现包涵体和细胞碎片)。稚虾、成虾及轻度感染的幼虾不出现病症。8 附录C(资料性)斑节对虾杆状病毒PCR产物序列GB/T 40249-2021 1 AATCCD.GGC GATCIThCCA AATACATTTC ATACCATAAC ACGTACCATG AACAACTTAT 261F 61 CAATAAAAGA GGATITACTA TCTATCCAGA TGCTTTATTC ATGATCATCA TTATAAATAC 121 GCTCATGAGT TCAACACTTC CGACTAT1立AAGGATCAATC AA丁fATGAAC丁CTATIGAATC181 TATGCTATTA CATGCGCTGA TTGAAATGAT GGTTAGTATT ACAACAATGA AGCTGGATAA 241 GGAGATGITC ATCAACGAAC G 261R