大肠杆菌测定.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,大肠菌群的测定,大肠菌群,:,一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌,.,分布：,分布较广，多存于温血动物粪便，人类粪便中或者被其污染的地方,测量意义：,该菌源于粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能,.,检测方法,国家标准检验方法（乳糖发酵法）,原理：,1,一群能发酵乳糖,产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌.,2 大肠菌群在36,o,C,+,2,o,C能在有胆盐存在下生长,MPN,:,最大可能数的简称,.,表示样品中活菌的密度,.,是用概率论来推算样品中菌数近似的数值,.,常用的单位,:,涂抹大肠实验,-MPN/100cm,2,液体大肠实验,-MPN/100ml,固体大肠实验,-MPN/100g,大肠空白没有单位,不用出结果,大肠菌群检验步骤,大肠菌群的检验步骤为检样稀释,.,依据国标,检样稀释,初发酵,(,乳糖发酵,),五步 分离培养,证实实验,(,复发酵,),结果报告,大肠菌群检测流程图,A.,检样稀释,1,)-,以无菌操作将检样,25g/ml,接种在装有,225ml,灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内,.,充分混合,制成,1:10,的均匀稀,(2)-,用,1ml,灭菌吸管,吸取,1:10,稀释液注人含有,9ml,灭菌生理的盐水或其它稀释液的灭菌试管内,混匀,制成,1:100,稀释液,无菌取样,样液稀释,充分振摇或研磨,25g,或,25ml,检样,225mL,稀释液,含有玻璃珠的灭菌玻璃瓶或乳钵,1:10,稀释液。,1ml,1ml,1ml,9ml,水,1:100,9ml,水,1:1000,9ml,水,1:10000,B.,初发酵,(,通常说的假定试验,目的在于检查样品中有无发酵产气的细菌,),将待检样品接种于乳糖胆发酵管内,.,接种量在,1ml,以上者,用双料管,1ml,及,1ml,以下者,用单料管,.,每一种稀释液接种,3,管,.,10*0.1,双,料,l,双,料,双,料,单,料,单,料,单,料,单,料,单,料,单,料,盐,水,1*0.1,1*0.01,1ml,0.1ml,0.01ml,0.01,0.1,稀,释,液,361,O,C培养箱内.培养2412h,如发酵都不产气,则报告大肠阴性如发酵有产气进行下步试验,C.,分离培养,将产气的样品接种伊红美兰培养基上,361,O,C,培养箱内培养,1824h,观察菌落形态,并做革兰氏染色证实实验,菌落形态,:,深紫黑色,具有金属光泽的菌落,紫黑色,不代或略带金属光泽的,菌落,淡紫黑色,中心色较深的菌落,(,可疑菌落,),粉红色,中心色无较深的菌落,倒平板,熔化已灭菌的培养基并冷却至,45,左右倒平板，每种培养基每个稀释度各三只平板。,菌落类型,D.,证实实验,(,复发酵,),在上述平板上,挑选典型菌落接种在乳糖发酵管中,置,361,o,c,培养箱内,培养,242h,观察产气情况,.,凡乳糖产气,革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌,即可报告为大肠菌群阳性,.,注意事项,(1).初发酵和证实试验:乳糖发酵实验系样品发酵,不是纯菌的发酵实验,所以初发酵阳性并不代表大肠菌群阳性,因此,必须做进一步证实实验.,(2).产气量与倒气管:,用于初发酵或复发 酵的导气管内应无气泡,作空 白对照,应以产气为主,产酸仅作参考,导气管口被样品颗粒封住,影响结果,3),挑选菌落,:,在平板呈黑色,有或无金属光泽,检出率最高,粉红色,粉色检出率最低,.,只挑选一个菌落影响大肠菌群的检出率,当菌落不典型时,应挑选,23,个菌落作证实试验,以免出现假阴性,.,(4)MPN,检索表,:,本表采用,3,个稀释度,即,1ml(g),0.1ml(g),0.01ml(g),若改用,10ml(g),1ml(g),0.1ml(g),时,表内数字应相应,降低,10,倍,.,若改用,0.1ml(g),0.01ml(g),0.001ml(g),时,表内数字应相应,增加,10,倍,.,快速测定方法,最可能数法,平板法,步骤与乳糖法相似。培养条件相同,最可能数（MPN)法,原理：大肠菌群可产生,-半乳糖苷酶。分解液体培养集中的酶底物MUGal,使4-甲基伞形酮游离，在336nm的紫外光灯下呈现蓝色荧光。可根据产生状况结合MPN表对大肠菌群进行测定,平板法,原理：大肠菌群可产生,-半乳糖苷酶。分解液体培养集中的酶底物,Aliz-gal,，使茜素有了并与固体培养基中的铝 铁 钾 铵离子结合形成紫色（或红色）络合物，使菌落呈现相应颜色,计数,当平板上的紫色（或红色）菌落不高于150个，且其中至少有一个平板紫色（或红色)菌落不少于15个则可按下式计数,快速测定流程,检样,稀释,MUGal肉汤（MPN)法,336nm紫外灯下暗处观察,有荧光,无荧光,阳性,阴性,报告,Aliz-gal琼脂（平板法）,报告,计数紫色（或红色）菌落,其他检验方法,LTSE快速检测法,疏水网膜法,TTC显色法,DC(去氧胆酸法)半固体试管法,纸片法,显色荧光法,PCR法,