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酵母细胞的固定化
课题5 酵母细胞的固定化
1. 游离酶、固定化酶和固定化细胞的比较
比较项目
游离酶
固定化酶
固定化细胞
及底物的接触面积
充分接触
部分接触
催化反应
催化某种酶促反应
催化一系列的酶促反应
催化效率
最高
较高
回收及重复利用
难
可以
固定方法
无
物理吸附法(吸附法)
化学结合法(交联法)
包埋法
固定理由
无
酶分子小，容易从包埋材料中漏出
细胞大，难以被吸附或结合
(1) 物理吸附法(吸附法)是将酶吸附在载体表面的一种固定方法。特点是工艺简便且条件温和，应用广泛。实质是利用酶及载体之间的范德华力实现吸附。
(2) 化学结合法(交联法)是利用酶及载体之间形成的共价键将酶进行固定的。

2. 酵母细胞的固定化
操作过程
理论依据
注意事项
成功标记
活化酵母细胞
新陈代谢旺盛的细胞自由水含量多
适宜的水温，容器要足够大
出现大量泡沫
配制CaCl2溶液
CaCl2溶于水
搅拌充分溶解

配制海藻
酸钠溶液
海藻酸钠难溶于水，固定需要适宜的浓度
小火或间断加热，边加热边搅拌;定容
没有焦糊，并完全溶化
混合
温度高会杀死活化的酵母菌;温度过低海藻酸钠溶液会凝固，不能及活化的酵母菌混合
冷却至室温，再加入活化的酵母菌，充分搅拌，防止出现气泡
没有气泡，液体状
固定化酵
母细胞
海藻酸钠形成的凝胶能够固定酵母细胞
恒定速率缓慢滴加到氯化钙溶液中，要在氯化钙溶液中固定30 min左右
凝胶珠的颜色较深，一般为乳白色或黄色，形状为圆形或椭圆形。凝胶珠一般沉在氯化钙溶液的底部
（1）活化:在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
（2）用蒸馏水配制CaCl2溶液,而不用自来水。原因是防止自来水中各种离子影响实验结果。
（3）CaCl2溶液的作用：使胶体聚沉，凝胶珠形成稳定的结构。
（4）海藻酸钠的作用：包埋细胞。
（5）刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
（6）检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
（7）如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。

3. 用固定化酵母细胞发酵
（1）配制麦芽汁或葡萄糖溶液:注意浓度适宜，过高会造成固定的酵母细胞失水，甚至死亡。
（2）葡萄糖的作用：既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。
（3）固定化酵母凝胶珠的处理:固定好的凝胶珠从氯化钙溶液取出后要用蒸馏水冲洗2~3次。洗去氯化钙溶液的目的是防止凝胶珠硬度过大，影响通透性。
（4）发酵:开始时凝胶珠沉在发酵液的底部，一段时间后慢慢上浮且有气泡产生，发酵液有酒味。
思考：
1.发酵过程中锥形瓶为什么要密封？

2.锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？

3.发酵时为什么要将温度控制在25℃？

例题：为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研人员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如下图所示。请回答:

(1) 及利用游离酵母生产啤酒相比，利用固定化酵母的优点有　 。
(2) 本实验结果表明，随氯化钙浓度增大，凝胶珠机械强度增大，完整率　　　　　。
(3) 结合发酵性能分析，制备凝胶珠适宜的氯化钙浓度为　　　　　。当氯化钙浓度过高时，发酵液中的糖度升高，酒精度下降，发酵受到影响，原因是　 　。
(4) 用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞，溶解海藻酸钠时最好采用　　　　　的方法，以防发生焦糊。溶化好的海藻酸钠溶液应　　　　　后，再及已活化的酵母细胞充分混合。若海藻酸钠浓度过低，会导致　　　　　　　　　　　　　　，固定效果大大降低。

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