植物转基因技术原理及要点.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物转基因技术原理及要点,李琳玲,1,2,1.技术路线,目的基因分离,植物表达载体的构建,受体材料的准备,遗传转化,转化组织,组织脱分化,转化植株筛选,炼苗,3,1.目的基因的分离,（1）已知基因的获得,化学合成法,PCR扩增,（2）未知基因的获得,构建基因组文库，筛选目的基因,构建cDNA文库，筛选目的基因,mRNA差异显示技术筛选差异表达基因,差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因,4,pGEM-T,银杏叶RNA提取,反转录cDNA,chs,全长cDNA的克隆,TA克隆及测序,向chs两端引入酶切位点,双酶切,定向克隆,导入农杆菌,2.,植物表达载体的构建,5,例 pBI121-,chs,构建,pBI121图谱,6,银杏,chs,基因植物表达载体构建示意图,chs,-glucuronidose,NOS ter,CaMV35P,chs,7,3.受体材料的准备,细胞的全能性：分化细胞脱分化 再分化,8,4.遗传转化,（1）间接转化法,农杆菌介导转化法,（2）直接转化法,A、基因枪转化法,B、电击法,C、花粉管通道法,D、PEG介导基因转化法,9,根癌农杆菌,(,Agrobacterium,tumefaciens,),是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有,Ti,质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤,.Ti,质粒,(,包括,Ri,质粒,),上有一段转移,DNA,在农杆菌侵染宿主植物时,这段,DNA,可以转移进植物细胞,并稳定地保留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗传给子代。,返 回,10,基因枪转化法由美国,Cornell,大学的,Sanfor,(1987),提出,它的主要原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒,(,钨粒或金粒,),表面,通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细胞内,然后通过组织培养再生出完整的植株,.,微粒上的外源,DNA,进入细胞后,整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化,.,。,返 回,11,电击法的主要原理是将原生质体在溶液中与,DNA,混合,然后利用高压电脉冲作用,使原生质体膜的某些部位被击穿而产生可回复的小孔,外源,DNA,可通过小孔进入原生质体内,而且不影响经电击处理的原生质体再生植物的能力,.,返 回,12,花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因转化,.,返 回,13,PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连,并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进入原生质体.,返 回,14,表1 几种植物转基因方法比较,转基因方法,转化的优点,转化的缺点,DNA间接转化法,农杆菌介导基因转移,受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化率高；,转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。,转化体常出现“嵌合”现象，需在严格条件下加以选择以淘汰未转化细胞,DNA直接转化法,（1）基因枪转化法,（2）电击法,（3）PEG介导基因转化法,（4）花粉管通道法,无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单,转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法）,15,5.转化组织,农杆菌介导之叶盘转化法,带有转化基因的农杆菌活化,受体植物,叶盘,侵染,共培养,筛选培养,诱导成苗,预培养叶盘，或愈伤组织,16,17,18,遗传转化主要的影响因素：,1.预培养时间：一般03天，过长不利于侵染,2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在 0.21.0）,3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆菌难以除净，毒害材料。,4.共培养时间,5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度,(A)仅共培养基中加AS,(B)仅菌液中加AS,(C)菌液和共培养基中均加AS,AS使用浓度：50M200M,实验结论：A与C效果最好且差异不明显,19,6.炼苗,20,7.转基因苗的筛选与鉴定,培养过程中利用标记基因筛选,标记基因,选择标记基因(,Slective gene),报告基因(Report gene),抗生素类选择基因,抗除草剂类选择基因,生物安全性标记类选择基因,-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus),荧光素酶基因(Luc),氯霉素乙酰转移酶基因(Cat),绿色荧光蛋白基因(Gfp),21,例 Gus检测,原理：葡萄糖酸苷酶基因（,Gus,），催化葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。,例：组织化学法测定Gus活性,作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛蓝；,22,转基因植物的PCR检测,外源基因整合的PCR-Southern杂交检测,外源基因拷贝的IPCR检测,外源基因表达的RT-PCR,23,杂交鉴定,外源基因整合的Southern 杂交鉴定,外源基因转录的Northern杂交检测,外源基因表达蛋白的检测,外源基因整合及表达的原位杂交检测,24,Southern杂交过程,25,8.转基因植物成果检测,26,Thank you!,27,