DB45∕T 2352-2021 猪主要病毒性腹泻防控技术规范(广西壮族自治区).pdf

ICS 11.CCS B 4广Techn2021 -220 41 西壮猪主ical spec- 07 - 27 发壮族主要病cificati发布 广西壮族自病毒性on of pre壮族自治区自治 性腹泻evention diarrh区市场监督区泻防控and conthea 督管理局 地DB控技术rol for m 发 布 4方标B45/T 235术规范major por2021 - 0布 45 标准522021 范 rcine vir08 - 31 实准 al 实施DB45/T 23522021 I 目次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 缩略语 . 1 5 诊断 . 2 5.1 总则 . 2 5.2 特点 . 2 5.3 临床症状 . 2 5.4 病理变化 . 3 5.5 实验室诊断 . 3 5.6 结果判定 . 3 6 防控措施 . 4 7 免疫预防 . 4 7.1 基本要求 . 4 7.2 疫苗 . 5 7.3 方法 . 5 7.4 仔猪 . 5 8 疫情监测 . 5 附录 A（规范性） PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 多重 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 检测方法 . 6 附录 B（规范性） PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 多重 RT-PCR 检测方法 . 9 参考文献 . 13 DB45/T 23522021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由广西壮族自治区农业农村厅提出并宣贯。 本文件由广西畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本文件起草人：施开创、冯淑萍、尹彦文、粟艳琼、陈芳芳、屈素洁、陆文俊、莫胜兰、李军。DB45/T 23522021 1 猪主要病毒性腹泻防控技术规范 1 范围 本文件规定了猪主要病毒性腹泻综合防控技术的诊断、防控措施、免疫预防、疫情监测等要求。 本文件适用于广西行政区域内规模猪场猪主要病毒性腹泻的综合防控。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 7959 粪便无害化卫生要求 GB 17823 集约化猪场防疫基本要求 GB/T 17824.2 规模猪场生产技术规程 GB/T 17824.3 规模猪场环境参数及环境管理 NY/T 1168 畜禽粪便无害化处理技术规范 NY/T 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 规模化猪场 intensive pig farm 采用现代养猪技术和设施设备，实行自繁自养、全年均衡生产工艺，存栏基础母猪100头以上的养猪场。 3.2 猪主要病毒性腹泻 major porcine viral diarrhea 由病毒引起的急性消化道传染病，以厌食、呕吐、腹泻、脱水为主要特征，其主要病原有猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PDCo：猪德尔塔冠状病毒病（porcine deltacorona） PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus） PED：猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea） PEDV：猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus） PoR：猪轮状病毒病（porcine rota） PoRV：猪轮状病毒（porcine rotavirus） DB45/T 23522021 2 TGE：猪传染性胃肠炎（porcine transmissible gastroenteritis） TGEV：猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus） 5 诊断 5.1 总则 根据疫病的特点、临床症状和病理变化等做出初步诊断，通过实验室病原学、血清学等诊断方法确诊。 5.2 特点 5.2.1 概述 具有典型的季节性，常发生于春、冬季，对哺乳仔猪造成的危害最为严重，呈现暴发流行或地方性流行。 5.2.2 PED 只有一个血清型，不同日龄、品种和性别的猪只均可感染、发病，感染率与病死率随着日龄的增长而下降，以哺乳仔猪感染率与死亡率最高，死亡率 50以上。 5.2.3 TGE 只有一个血清型，对 7 日龄以内的哺乳仔猪危害较大，病死率 70以上。 5.2.4 PoR 具有多个血清型，14 周龄仔猪群，多发于 10 日龄以内的仔猪，发病率 70以上，病死率 720。 5.2.5 PDCo 只有一个血清型，可引起 515 日龄哺乳仔猪发病，发病率和死亡率均为 50以上。 5.3 临床症状 5.3.1 PED 新生仔猪多发， 症状为厌食、 呕吐、 腹泻、 脱水等。 发病仔猪颤抖、 打堆， 出现腥臭味的水样腹泻。随着腹泻的发展，仔猪会因脱水而眼窝下陷、被毛粗乱。部分仔猪腹泻3 d4 d后死亡，死前侧卧、四肢划动、口吐白沫。育肥猪、成年猪的临床症状较轻。 5.3.2 TGE 17日龄的仔猪主要症状为沉郁、厌食、呕吐、水样腹泻，粪便呈淡绿色或黄绿色，恶臭；患病猪消瘦，运动共济失调。断奶猪、育肥猪及成年猪临床症状较轻，主要为食欲下降或消失，个别猪只出现水样腹泻、呕吐等。 5.3.3 PoR 发病初期，猪只症状临床症状为沉郁、厌食、不爱走动等症状，部分仔猪吃奶后出现吐奶、腹泻，持续一周以后，脱水严重，体重减轻。成年猪和育肥猪不易发病。 DB45/T 23522021 3 5.3.4 PDCo 发病猪主要临床症状为严重厌食、腹泻、呕吐、脱水，仔猪致死率高。 5.4 病理变化 5.4.1 PED 消瘦、脱水，胃内有黄白色的凝乳块。小肠肠管膨满扩张、充满黄色和灰黄色液体，肠壁变薄、肠系膜充血，个别猪只小肠黏膜有散在出血点、肠系膜淋巴结肿大。 5.4.2 TGE 小肠黏膜肿胀、潮红，局部附有粘液，部分还有糜烂和溃疡。膀胱黏膜肿胀，有散在出血点。脑膜充血。脑质较软、多汁并有小出血点。 5.4.3 PoR 胃膨大、扩张，胃黏膜呈暗黑色，胃部可见未消化乳汁和凝乳块。肠道明显鼓气，偶见小肠出现弥漫性充血。 5.4.4 PDCo 胃肠道粘膜损伤，肠壁变薄、松弛，盲肠、结肠扩张。病程严重时出现腹腔、胸腔积水。 5.5 实验室诊断 5.5.1 病毒分离与鉴别诊断 5.5.1.1 PEDV、PoRV 将 PEDV、PoRV 疑似样品接种非洲绿猴肾细胞（Vero 细胞），并对其培养物进行细胞传代培养，通过细胞病变、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、间接免疫荧光（IFA）等方法对传代细胞毒进行鉴定。 5.5.1.2 TGEV、PDCoV 将 TGEV、PDCoV 疑似样品接种猪肾细胞，并对其培养物进行细胞传代培养，通过细胞病变、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、间接免疫荧光（IFA）等方法对传代细胞毒进行鉴定。 5.5.2 病原检测 样品按照附录A和附录B的方法进行检测。 所使用引物、 探针序列及扩增目的基因片段序列见附录A、附录B。 5.5.3 抗体检测 采集发病初期和发病3周后的血清，使用商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒进行检测。 5.6 结果判定 5.6.1 初步诊断 流行特点、临床症状和病理变化符合5.2、5.3和5.4 ，诊断为疑似相应的病毒性腹泻发病猪。 DB45/T 23522021 4 5.6.2 确诊 5.6.2.1 按 5.5.1、 5.5.2 实验室诊断 PEDV、 TGEV、 PDCoV 或 PoRV 检测结果阳性者， 确诊为相应疫病。 5.6.2.2 非免疫猪只 PEDV、TGEV、PDCoV 或 PoRV 特异性抗体检测结果阳性者，确诊为相应疫病。 6 防控措施 6.1 猪场应实行预防为主，预防与控制、净化、消灭相结合的方针，加强饲养管理和生物安全措施，做好疫病的综合防控。 6.2 猪场实行兽医防疫、卫生管理场长负责制。应配备与饲养规模相适应的，具有从业资格的兽医技术人员。定期对猪场员工进行生产技术、疫病防控、生物安全、管理制度等培训。 6.3 坚持自繁自养，实行封闭式饲养管理。如需引种，应按动物防疫相关要求进行检疫，引进种猪应隔离观察 45 d 后再次进行检测，确认 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 为阴性的猪只方可混群饲养。 6.4 实行全进全出管理模式。每批猪出栏后均应对猪舍进行严格的清洗消毒，并空栏 7 d 以上方可再次进猪。猪场每年全场应彻底消毒 34 次。 6.5 猪场应制定完善的消毒制度， 并严格执行； 猪场入口和生产区入口设置消毒设施， 对车辆、 人员、物品规范消毒，并做好记录；生产区入口处应配备淋浴设施，人员进入生产区前应沐浴、更衣。 6.6 猪场的销售展示厅和装猪台应与生产区隔离，设立有车辆、人员独立通道。 6.7 猪场应安装防鸟、防鼠、防蚊、防蝇网等防护设施，定期灭鼠、灭蚊、灭蝇。 6.8 设立专用病猪隔离舍，对病猪进行隔离观察。设立独立的兽医室。在远离生产区、下风处建立专门的病死猪无害化处理区。 6.9 猪场应符合 GB/T 17824.2 的规定，温度、湿度适宜，饲养密度合理，通风良好。应做好季节性降温保暖措施。 6.10 猪场环境质量控制应按照 GB/T 17824.3 的要求执行。 6.11 猪场卫生防疫应按照 GB 17823 的要求执行。 6.12 饮用水水质应符合 NY/T 5027 的规定。 6.13 建立种猪引种、配种、分娩、防疫、免疫、检测、监测、用药、消毒等制度及档案记录。规范记录猪场投入品采购使用、免疫、消毒、检测监测、疫病诊疗、无害化处理、产品销售等，并整理归档。 6.14 加强投入品管理，不应使用违禁品，不应超剂量、超范围使用抗菌药物，严格执行休药期。 6.15 饲养员不应互串猪舍。人员进入猪舍前应经消毒池、手部消毒盆消毒。 6.16 猪场内不应饲养其它动物。员工不应将猪肉、其它动物肉类及其副产品带入场。 6.17 废弃物应无害化、 环保性、 资源化循环利用处理。 对病死猪及淘汰猪按照 NY/T 1168 处理； 粪便、污水等按照 GB 7959、NY/T 1168 的要求处理。 6.18 受污染，饲料、垫料、过期或残余疫苗和兽药、一次性养殖用品(如注射器、输液针、输精管等)及包装物等废弃物应集中堆放并进行无害化处理。 6.19 对确诊的病猪，应加强饲养管理，注意防寒保暖、防暑降温，减少应激因素；补充口服盐水，使用抗病毒中草药和抗菌药物；转移病猪至隔离舍，观察治疗。淘汰弱猪、僵猪、无饲养价值病猪；对淘汰猪、病死猪进行无害化处理。 7 免疫预防 7.1 基本要求 制定和实施科学合理的免疫程序。 DB45/T 23522021 5 7.2 疫苗 7.2.1 针对 PEDV、 TGEV、 PoRV 使用猪流行性腹泻、 猪传染性胃肠炎、 猪轮状病毒三联活疫苗实行免疫，PDCoV 目前暂无商品化疫苗。 7.2.2 疫苗应按说明书要求保存。疫苗稀释后摇匀，并在 1 h 内使用完毕。疫苗瓶不应乱扔，应集中无害化处理。 7.2.3 应由专人保管、使用疫苗。不应使用无批准文号、过期、变质、失效的疫苗。 7.3 方法 7.3.1 后备母猪 配种前免疫 2 次，每次间隔 21 d。 7.3.2 妊娠母猪 预产期前 40 d 和 15 d 分别于后海穴接种 2 头份/头。 7.4 仔猪 免疫母猪所产仔猪断奶后 7 d10 d 于后海穴接种 1 头份/头；未免疫母猪所产仔猪产后 3 d 于后海穴接种 1 头份/头。 8 疫情监测 8.1 加强猪群生产和防疫管理，定期进行 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 病原和抗体的监测。 8.2 加强猪群日常临床观察和监测， 及时发现精神不振、 采食减少、 体温升高、 消瘦体弱等异常情况。 8.3 对出现厌食、呕吐、腹泻、脱水等严重腹泻症状的猪群，选取部分猪只，采集肛拭子和粪便拭子，严重病例剖检采集组织样品，按 4.5.2 检测 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 病原；非疫苗免疫猪群，可采集血清，按 5.5.3 检测 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 抗体。 8.4 按 4.5.2 或 4.5.3 方法检测，PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 病原或抗体检测结果呈阳性，立即隔离治疗或淘汰，病死猪按照 NY/T 1168 进行处理。 DB45/T 23522021 6 A A 附录A （规范性） PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 多重 TaqMan 荧光定量 RT-PCR 检测方法 A.1 引物及探针序列 见表 A.1。 表A.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 引物及探针序列 引物 序列（53） 目的基因 片段大小/bp PEDV-N-F CTGGAATGAGCAAATTCGCTG PEDV-N 140 PEDV-N-R CAACCCAGAAAACACCCTCAG PEDV-N-P JOE-AGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCA-BHQ1 TGEV-M-F GCAATTCTTTGCGTTAGTGCAT TGEV-M 102 TGEV-M-R AGCGTACAAATTCCCTGAAAGC TGEV-M-P TexasRed-CTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGG-BHQ2 PDCoV-M-F ATCGACCACATGGCTCCAA PDCoV-M 72 PDCoV-M-R CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT PDCoV-M-P 6-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-BHQ1 PoRV-VP6-F AATATGACACCAGCAGTTGCAAA PoRV-VP6 107 PoRV-VP6-R ACAGATTCACAAACTGCAGATTCAA PoRV-VP6-P Cy5-CAAGCACCACCATTTATATTTCATGCTACA-BHQ3 A.2 重组质粒标准品的构建 A.2.1 重组质粒构建 提取PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV病毒液总RNA，反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDV N基因（140 bp）、TGEV M基因（102 bp）、PDCoV M基因（72 bp）、PoRV VP6基因（107 bp）片段。经回收、连接pMD-18T载体、转化DH5感受态细胞，阳性克隆提取质粒，进行PCR鉴定和测序鉴定， 构建4种重组质粒作为阳性标准品， 分别命名为p-PEDV-N、 p-TGEV-M、 p-PDCoV-M、 p-PoRV-VP6。 A.2.2 扩增的目的基因片段 A.2.2.1 扩增的 PEDV 目的片段 扩增 PEDV N基因140 bp片段。N基因扩增序列为CTGGAATGAGCAAATTCGCTGGCGCATGCGCCGTGGTGAGCGAATTGAACAACCTTCCAATTGGCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGGCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTG。 A.2.2.2 扩增的 TGEV 目的片段 扩增 TGEV M基因102 bp片段。M基因扩增序列为GCAATTCTTTGCGTTAGTGCATTAGGAAGAAGCTATGTGCTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGGTGTCACTCTAACTTTGCTTTCAGGGAATTTGTACGCT。 A.2.2.3 扩增的 PoRV 目的片段 扩增PoRV VP6基因107 bp片段。VP6基因扩增序列为AACATGACACCAGCGGTCGCAAACCTATTTCCGCAAGCAC DB45/T 23522021 7 CACCATTTATATTTCATGCTACAGTTGGACTTACGCTACGAATTGAATCTGCAGTTTGTGAATCTGT。 A.2.2.4 扩增的 PDCoV 目的片段 扩增 PDCoV M 基因 72 bp 片段。M 基因扩增序列如下：ATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTG。 A.3 待检样品处理 A.3.1 组织样品 取病猪的小肠组织1 g2 g，置于2.0 mL EP管中，加入灭菌的1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织匀浆机或研钵充分研磨捣碎组织样品后，反复冻融3次；以10 000g离心5 min，收集上清，用于总RNA抽提，或置-20保存备用。 A.3.2 肛拭子、粪便拭子样品 将样品置于2.0 mL EP管中，加入灭菌的1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，在漩涡振荡器上振荡30 s，以10 000g离心5 min，收集上清，用于总RNA抽提，或置-20保存备用。 A.4 反转录 A.4.1 反应液总量20 L，在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列用量分别加入各成分： 5RT 缓冲液 4 L； AMV 反转录酶（5 U/L）0.5 L； dNTP 混合物（各 10 mM/L）1 L； RNA 酶抑制剂（40 U/L）0.5 L； 随机引物 6 聚体（50 pmol/L）1.5 L； 样品总 RNA 模板：5 L； 灭菌双蒸水：7.5 L。 A.4.2 加完试剂后立即离心混匀。 将PCR管置于PCR仪内进行反转录， 获得的cDNA直接用于多重PCR扩增，或置-20保存备用。反应程序如下： a) 30保温 10 min； b) 45反转录 45 min； c) 95 反转录酶失活反应 5 min。 A.5 多重 TaqMan 荧光 PCR 反应 A.5.1 反应液总量25 L，在冰浴条件下，在PCR反应管中按下列用量分别加入各成分： Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)12.5 L； PEDV-N 和 PoRV-VP6 上、下游引物（25 pmol/L）及探针（25 pmol/L）各 0.5 L； TGEV-M 和 PDCoV-M 上、下游引物（25 pmol/L）及探针（25 pmol/L）各 0.3 L； 灭菌双蒸水 5.7 L。 A.5.2 加完试剂后瞬时离心混匀，将PCR管置于荧光PCR仪内，反应程序如下： a) 95热变性 20 sec； b) 95变性 1 sec； c) 58收集荧光信号 45 sec, 40 个循环。 522021 判定 菌双蒸水为阴6质粒标准品循环，阴性对照的判定结果如出现 PEDV 的特之，判定为 PE出现 TGEV 的特反之，判定为出现 PDCoV 的反之，判定为出现 PoRV 的特判定为 PoRV 阴荧光定量 RT-序号说明： p-TGEV-M； p-PEDV-N； p-PDCoV-M； p-PoRV-VP6； TGEV（+） ； PEDV（+） ； PDCoV（+） ；PoRV（+） ； 阴性对照。 阴性对照，混合物为阳性照无扩增曲线下： 特异性扩增曲EDV 阴性，记特异性扩增曲为 TGEV 阴性，的特异性扩增为 PDCoV 阴性特异性扩增曲阴性，记为 P-PCR 产物扩增 图A.1 多使用浓度均性对照，进行线或Ct值3曲线，且 Ct 值记为 PEDV（-曲线，且 Ct 值记为 TGEV曲线，且 Ct，记为 PDCo曲线，且 Ct 值PoRV（-）。增曲线图 多重 TaqMan 荧均为每L107行扩增反应。36个循环，实值36 个循-）； 值36 个循（-）； 值36 个循oV（-）； 值36 个循环 荧光定量 RT-拷贝的p-PE。当阳性对照实验结果成立环，判定为环，判定为 循环，判定为环，判定为 P-PCR 产物扩增EDV-N、p-TG照反应出现典立。反之，此PEDV 阳性，TGEV 阳性，为 PDCoV 阳性PoRV 阳性，记增曲线图 GEV-M、p-PD典型S形扩增此次检测无效记为 PEDV（，记为 TGEV性，记为 PDCo记 PoRV（+）DCoV-M、曲线且Ct 。实验结（+）；反（+）；oV（+）；反之， DB45/T 23522021 9 B B 附录B （规范性） PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 多重 RT-PCR 检测方法 B.1 引物序列 见表 B.1。所扩增目的基因片段序列见 B.2。 表B.1 PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV 引物序列 引物 序列（53） 目的基因 片段大小/bp PEDV-N F: GCATTTCTACTACCTCGGAA PEDV-N 750 R: GCGATCTGAGCATAGCCTGA TGEV-M F: GCGTCTGATTGTGAGTCATG TGEV-M 544 R: GAATAGTCCTGCTGGGTAATG PDCoV-N F: GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATG PDCoV-N 183 R: CTGGGCCATCTCCGGTTGGGAATC PoRV-VP6 F: CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTC PoRV-VP6 329 R: CGTTTCGTCGCGACTCTCTAG B.2 重组质粒标准品的制备 B.2.1 重组质粒构建 使用商品化试剂盒提取PEDV CV777株、TGEV H株、PDCoV GX1701株、PoRV NX株病毒液总RNA，反转录成cDNA后作为模板，应用特异性引物进行PCR扩增，获得PEDV N基因750 bp、TGEV M基因544 bp、PDCoV N基因183 bp、PoRV VP6基因329 bp。回收、纯化PCR产物，连接至pMD18-T载体、转化E.coli DH5感受态细胞，阳性克隆增菌培养后提取质粒。经PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定正确后，所获得重组质粒作为阳性标准品，分别命名为pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N、pPoRV-VP6。 B.2.2 扩增的目的基因片段序列 B.2.2.1 扩增的 PEDV 目的基因片段序列 扩增PEDV N基因750 bp片段。N 基因扩增序列如下：GCATTTCTACTACCTCGGAACAGGACCTCACGGCGACCTCCGTTATAGGACTCGTACTGAGGGTGTTTTCTGGGTTGCTAAAGAAGGCGCAAAGACTGAACCCACTAATTTGGGTGTCAGAAAGGCGTCTGAAAAGCCAATCATTCCAAAATTCTCTCAACAGCTCCCCAGTGTAGTTGAGATTGTTGAACCTAACACACCTCCTGCTTCACGTGCAAATTCGCGTAGCAGGAGTCGTGGCAATGGCAACAATAGGTCTAGATCTCCAAGTAACAACAGAGGCAATAACCAGTCCCGTGGTAATTCACAGAATCGTGGAAATAACCAGGGTCGTGGAGCTTCTCAGAACAGAGGAGGCAATAATAATAACAATAACAAGTCTCGTAACCAGTCCAATAACAGGAACCAGTCAAATGACCGTGGTGGTGTAACATCACGCGATGATCTGGTGGCTGCTGTCAAGGATGCACTTAAATCTTTGGGTATTGGAGAAAATCCTGACAGGCATAAGCAACAGCAGAAGCCTAAGCAGGAAAAGTCTGACAACAGCGGCAAAAATACACCTAAGAAGAACAAATCCAGGGCCACTTCGAAGGAACGTGACCTCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAATTCCCAAGGGCGAAAATAGCGTAGCAGCTTGCTTCGGACCCAGAGGGGGCTTCAAAAACTTTGGAGATGCGGAATTTGTCGAAAAAGGTGTTGATGCGTCAGGCTATGCTCAGATCGC。 B.2.2.2 扩增的 TGEV 目的基因片段序列 扩增 TGEV M基因 544 bp片段。M 基因扩增序列如下：GCGTCTGATTGTGAGTCATGCTTCAACGGAGGCGATCTTATTTGGCATCTTGCAAACTGGAACTTCAGCTGGTCTATAATATTGATCGTTTTTATAACTGTGCTACAATATGGAAGACCTCAATTCAGDB45/T 23522021 10 CTGGTTCGTGTATGGCATTAAAATGCTTATAATGTGGCTATTATGGCCCGTTGTTTTGGCTCTTACGATTTTTAATGCATACTCGGAATACCAAGTGTCCAGATATGTAATGTTCGGCTTTAGTATTGCAGGTGCAATTGTTACATTTGTACTCTGGATTATGTATTTTGTAAGATCCATTCAGTTGTACAGAAGGACTAAGTCTTGGTGGTCTTTCAACCCTGAAACTAACGCAATTCTTTGCGTTAGTGCATTAGGAAGAAGCTATGTGCTTCCTCTCGAAGGTGTGCCAACTGGTGTCACTCTAACTTTGCTTTCAGGGAATTTGTACGCTGAAGGGTTCAAAATTGCAGGTGGTATGAACATCGACAATTTACCAAAATACGTAATGGTTGCATTACCTAGCAGGACTATTG。 B.2.2.3 扩增的 PoRV 目的基因片段序列 扩增 PoRV VP6基因 329 bp片段。VP6基因扩增序列如下：CTTCGACATGGAGGTTCTGTACTCATTGTCAAAAACCTTAAAAGATGCTAGAGATAAAATTGTTGAAGGTACATTATACTCAAATATAAGTGATTTAATTCAACAGTTCAATCAAATGATAGTTACCATGAATGGAAATGATTTTCAAATGGGAGGAATAGGAAATTTGCCAATCAGAAACTGGAATTTTGATTTCGGATTACTTGGCACTACTTTACTTAATATAGATGCAAATTATGTTGAAAATGCTAGAACTACCATTGAATATTTCATTGATTTTATAGATAATGTGTGTATGGATGAAATGGCTAGAGAGTCGCGACGAAACG。 B.2.2.4 扩增的 PDCoV 目的基因片段序列 扩增 PDCoV M 基因 183 bp 片段。M 基因扩增序列如下：GTCCCAGAGGAAATCTTAAGTATGGTGAACTCCCTCCTAATGATACCCCAGCAACCACTCGTGTTACTTGGGTTAAGGGTTCGGGAGCTGACACTTCTATTAAACCTCATGTTGCCAAACGCAACCCCAACAATCCTAAACATCAGCTGCTACCTCTCCGATTTCCAACCGGAGATGGCCCAG。 B.3 待检样品处理 待检样品处理如下： 组织样品：采取病猪的小肠组织约 1 g2 g，置于 2.0 mL 离心管中，加入灭菌的 1 mol/L PBS（pH 7.2）1 mL，用组织匀浆机或研钵充分研磨后，反复冻融 3 次；以 10 000g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置-20保存备用； 肛拭子、粪便拭子样品：置 2.0 mL 离心管中，加入灭菌的 1 mol/LPBS（pH 7.2）1 mL，在振荡器上振荡 30 s，以 10 000g 离心 5 min，收集上清，用于总 RNA 抽提，或置-20 保存备用； 取 200 L 待检样品于无 RNA 酶的 1.5 mL 离心管中，按照 RNA 提取试剂盒说明书操作抽提总RNA。 B.4 反转录 RT-PCR 反应 B.4.1 反转录 B.4.1.1 反应液总量 20 L，在冰浴条件下，在 PCR 反应管中按下列用量分别加入各成分： 5RT 缓冲液 4 L； AMV 反转录酶（5 U/L）0.5 L； dNTP 混合物（各 10 mM/L）1 L； RNA 酶抑制剂（40 U/L）0.5 L； 随机引物 6 聚体（50 pmol/L）1.5 L； 样品总 RNA 模板 5 L； 灭菌双蒸水 7.5 L。 B.4.1.2 加完试剂后立即离心混匀。将 PCR 管置于 PCR 仪内进行反转录，获得的 cDNA 直接用于多重PCR 扩增，或置-20保存备用。反应程序如下： a) 30保温 10 min； b) 45反转录 45 min； DB45/T 23522021 11 c) 95反转录酶失活反应 5 min。 B.4.2 PCR扩增 B.4.2.1 反转录后，以获得的 cDNA 为模板建立 50 LPCR 反应体系。在冰浴条件下，按下列用量 PCR管中分别加入以下成分： 2TaqPCR MasterMix 25 L； PEDV-N 上、下游引物（25 pmol/L）各 1 L； TGEV-M 上、下游引物（25 pmol/L）各 1 L； PoRV-VP6 上、下游引物（25 pmol/L）各 1.25 L； PDCoV-M 上、下游引物（25 pmol/L）各 1.25 L； cDNA 模板 5 L； 灭菌双蒸水 11 L。 B.4.2.2 加完试剂后立即离心混匀。将 PCR 管置于普通 PCR 仪内，反应程序如下： a) 94热变性 5 min； b) 94变性 30 s； c) 56复性 30 s； d) 72聚合 35 s，35 个循环； e) 72延伸 10 min。 B.5 结果判定 以灭菌双蒸水为阴性对照，以pPEDV-N、pTGEV-M、pPDCoV-N 和 pPoRV-VP6重组质粒标准品混合物（使用浓度均为107拷贝/L）为阳性对照，进行多重RT-PCR反应。1.5琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统观察结果并拍照。当阴性对照无任何DNA扩增带，而阳性对照在约750 bp、544 bp、329 bp和183 bp位置出现DNA扩增带，则实验结果成立；否则，此次检测无效。实验结果成立时的具体判定结果如下： 被检样品在 750 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PEDV 阳性，标记为 PEDV（+）；若被检样品在 750 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 PEDV 阴性，标记为 PEDV（-）； 被检样品在 544 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 TGEV 阳性，标记为 TGEV（+）；若被检样品在 544 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 TGEV 阴性，标记为 TGEV（-）； 被检样品在 329 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PoRV 阳性，标记为 PoRV（+）；若被检样品在 329 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 PoRV 阴性，标记为 PoRV（-）； 被检样品在 183 bp 位置出现 DNA 扩增带，判定为 PDCoV 阳性，标记为 PDCoV（+）；若被检样品在 183 bp 位置未出现 DNA 扩增带，判定为 PDCoV 阴性，标记为 PDCoV（-）。 B.6 多重 RT-PCR 产物凝胶电泳图 见图B.1。 DB45/T 23512 标引序MD1阳2P3T4P5P6阴 522021 序号说明： DNA 分子质量标阳性对照； PEDV（+） ； TGEV（+） ； PoRV-VP6（+）PDCoV-M（+） ；阴性对照。 图B.1 标准（DL2, 00； PEDV、TGE 00 Marker） ； EV、PDCoV 和 和 PoRV 多重C RT-PCR 产物物琼脂凝胶电电泳图 12 GB 13078 GB/T 17824饲料卫生标4.1 规模猪参标准 猪场建设 参考文献 DB45/T 2352202113 中华人民共和国广西地方标准 猪主要病毒性腹泻防控技术规范 DB 45/T 23522021 广西壮族自治区市场监督管理局统一印刷 版权专有 侵权必究