菌种的保存-真空冷冻干燥法.doc

菌种的保存：真空冷冻干燥法
1准备安培管 用于真空冷冻菌种保藏的安培管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安培管。大小要求外径6～7.5mm，长105 mm，球部直径9～11 mm，壁厚0.6～1.2 mm，也可用没有球部的管状安培管。先用2%盐酸浸泡8～10h，再经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；在每管内放入打好菌号及日期的标签，字面朝向管壁，管口塞好脱脂棉塞，121℃下高压灭菌20分钟，备用。

2准备菌种 用真空冷冻干燥法保藏的菌种保藏期可长达几年甚至几十年，为了不出现差错，所用菌种纯度要高，而且菌龄要适宜。细菌和酵母菌的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活期反而降低。一般细菌的菌龄要求24～48h；酵母菌为3d；形成孢子的微生物则宜保藏孢子；放线菌和丝状真菌菌龄为7～10d。

3保护剂的选择和准备 选取新鲜牛奶作为保护剂，牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂， 115℃下高压蒸汽灭菌25min，备用。

4菌种准备及分装 菌种要求为生长良好的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂，用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种，则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。悬液中菌数要求达到108～1010个/ml为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部，每管分装量约0.1～0.2毫升，分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

5 预冻 -80℃冰箱预冻1～2小时。

6冷冻干燥 将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。终止干燥时间应根据下列情况判断：①安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状；②真空度接近空载时的最高值；③选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结。

7封口 抽真空干燥后，取出安培瓶，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7Pa（0.2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安培管颈中央进行封口。

8保藏 安瓿管保藏在-20℃冰箱里。

9活化 如果要从中取出菌种恢复培养，可先用75%酒精将管的外壁消毒，用镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端，使管子破裂，在安瓿管中加入0.5～1ml液体培养基，慢慢旋转安瓿管，使冻干菌种复水，然后直接接种到琼脂斜面或涂布平板。