细胞一氧化氮检测.doc

NO Assay
(BioAssay Systems--QuantiChrom TM Nitric Oxide Assay Kit )
原理: NO能被氧化成亚硝酸盐和硝酸盐，从而通过测定亚硝酸根离子NO2-/硝酸根离子NO3-的总量来确定NO水平。
样品制备：
1.用1mL枪头吸弃每孔上层细胞培养基1mL，先横刮3次再竖刮3次，刮起剩下1mL细胞培养液，然后用1mL枪头冲吹细胞3次，显微镜下计数细胞数，收集1×106细胞于1.5mL离心管中，置于冰上。
2.于40C，5000rpm离心3min，吸弃上清液，收集细胞沉淀。
3.向细胞沉淀中加入1mL冰上预冷的1×PBS液，用200uL枪头混匀后于40C，5000rpm离心3min。吸弃上清液，收集细胞沉淀，置于冰上。
4.向细胞沉淀中加入150uL细胞裂解液 ，用200uL枪头混匀后于冰上裂解30min。
5.于40C，12000rpm离心10min。
6.向150uL细胞裂解液中加入8uL ZnSO4，vortex上混匀，然后加入8uLNaOH，vortex上混匀，于40C，14000rpm离心10min。取上清液，按50uL/管分装，作为NO检测样品。
标准曲线制作：
稀释标准品：取25uL 1.0mM 标准品，加入225uL ddH2O，用200uL枪头混匀，将标准品稀释成100uM Premix。
按下表制作标准曲线：
No.
Premix+ddH2O
Nitrite(uM)
1
0uL+100uL
0
2
20uL+80uL
20
3
40uL+60uL
40
4
60uL+40uL
60
5
80uL+20uL
80
样品NO水平测定：
1. WR工作液配制：将25uL Reagent A，25uL Reagent B和50uL Reagent C于1.5mL离心管中充分混匀。
2. 样品及标准品反应：将50uL样品和标准品与100uL WR工作液于1.5mL离心管中混匀，于600C孵育10min。
3. 测定：将反应好的样品与标准品加到96孔板中，于500-570nm(峰值540nm)测定OD值。
4. NO浓度计算：（按如下公式计算）
【NO】=(ODsample-ODblank)/slope (uM)，
注：ODblank为空白对照吸光值，slope为标准曲线斜率。其中1uM Nitrite=30pg/mL NO