第八章-病毒感染的分子生物学检验PPT参考课件.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2,*,湖南省中医药大学生化与分子生物学教研室,Jake li,临床分子生物学检验,第八章 病毒感染的分子生物学检验,1,2,感染性疾病是由特定病原体,感染机体后,所产生的一类疾病。,病原体包括病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和寄生虫等。可采用微生物学、生物化学、免疫学和血液学的方法对这些病原体进行检测，但是这些方法受灵敏度和特异性的限制，在明确病因、潜在感染、早期诊断以及对病原体进行分类、分型鉴定等方面还存在着较大的缺陷。,随着分子生物学的突破性发展以及相关技术的进步，优于传统诊断方法的分子诊断技术在疾病早期诊断、疗效监测、耐药基因分析等凸显优势，并被广泛应用于病原生物感染性疾病的检测中。,2,2025/6/13 周五,第一节 病毒感染的分子生物学检验策略,大约,70%,的人类感染性疾病是由病毒引起的,有超过,400,种以上的病毒可感染人类。,病毒除引起急性感染外，与其他的病原微生物相比，导致持续性感染比较多见。,所谓持续性感染是指在原发感染之后病毒不能从宿主中被清除，并且继续存留在机体特定的细胞中。,病毒在机体内可持续数月至数年，可出现症状，也可不出现症状而长期带毒，成为重要的传染源，如,HBV,、,HIV,等。因此对病毒感染的个体进行动态监测病毒载量、分析病毒感染类型、检测耐药基因及抗议病毒疗效观测等显得尤为重要。,3,2025/6/13 周五,一、病毒感染的一般性检出策略,病毒感染的分子诊断策略分为,一般性检出策略和完整性检出策略。,一般性检出策略,，,只能提供是否存在某种病病毒感染，即针对病毒的特异性核酸序列通过常用核酸杂交或,PCR,技术,直接检出病原体的核酸,，临床可用作判断有无感染和是何种病原体感染，是快速诊断机体有无病毒感染的首选方法。,可以根据病毒本身的保守序列（如,DNA,分子中的一个核苷酸片段或蛋白质中的氨基酸片段）设计,PCR,引物或制备特异性探针。,4,2025/6/13 周五,二、病毒感染的完整性检出策略,完整性检出策略,，即不仅对病原体的存在与否做出明确判断，同时能够诊断出病毒携带者和潜在性感染者，并能对病毒进行拷贝数测定、基因分型（包括亚型）检测和耐药性鉴定。常采用核酸杂交、,PCR,、基因芯片和,DNA,测序等技术。,5,2025/6/13 周五,第二节,乙型肝炎病毒的分子生物学检测,乙型肝炎病毒（,hepatitis B virus,HBV,）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一。根据有关资料统计，全球约有,3.5,亿乙肝病毒携带者，我国约,50,70,的人群感染过乙肝病毒，其中乙肝病毒携带者已超过,1.3,亿，肝癌发病率也在增加。,6,2025/6/13 周五,急性感染,慢性携带者,缓解,30-50 年,慢性肝炎,稳定,疾病进展,肝硬化,代偿性肝硬化,肝癌,死亡,非代偿性肝硬化,HBV,感染后可以引起急性、慢性病毒肝炎，而且与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切的关系。,7,2025/6/13 周五,HBV,感染者的可能转归,13,岁,25-30,岁,42,5,岁,免疫系统,免疫系统 免疫功能低下 慢性,识别病毒 清除病毒 反复清除 乙肝,幼年,感染,免疫功能正常,肝纤维化,终生不识别 病毒清除,肝硬化,失代偿性肝硬化,肝癌,终生携带,e,抗原,/e,抗体,无症状 血清转换,无体征 产生,s,抗体,8,2,一、乙型肝炎病毒的基因组结构特征,乙型肝炎病毒属嗜肝,DNA,病毒科。,嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合成,以,RNA,中间体为模板，经反转录合成,DNA,链，,在某些方面，,HBV,与逆转录病毒有许多相似性。,9,2025/6/13 周五,HBV DNA,是带有单链区的环状双链,DNA,分子，是已知可感染人类最小的,DNA,病毒。,基因组长为,3.2kb,，相对分子量为,(1.62.0)10,6,。,HBV,的两条链长度不等。长链为负链,L(-),：长度固定，携带有病毒全部的编码,信息。为模板编码病毒蛋白；,短链为正链,S(+),：在不同的,分子中长度不等，约负链的,50%,100%,。,（一）乙型肝炎病毒基因组结构,10,2025/6/13 周五,端,有一段短,RNA,，它们是引导,DNA,合成的引物。两条链的,5,端以,250-300,对碱基互补结合，所以也称黏性末端，是,DNA,保持双链环状的基础，也是,HBV,最常整合到肝细胞染色体中的,DNA,。,长链和短链,DNA,的,5,端位置是固定的，但短链的,3,端是可变的。在负链的,5,端一低分子量的蛋白质，在正链,5,11,2025/6/13 周五,在黏性末端的两侧还各有,11,个核苷酸,(5,-TCACCTCTGC-3,),构成的,顺向重,复序列,(DR),，,DR1,位于,长链的,5,端，,DR2,位于,短链的,5,端，中间相,隔,223,个核苷酸，,DR,是,DNA,成环及病毒复制的,关键区域。,12,2025/6/13 周五,HBV DNA,为了能在细胞内独立复制，充分利用其遗传物质，其编码区有广泛的重叠，以扩允其编码容量。,多个,ORF,可读码,2,次以上，编码,2,个以上蛋白质。,HBV,基因组负链,DNA,核苷酸序列上含有,6,个开放读码框架（,ORF),，其中,S,、,C,、,P,、,X 4,个,ORF,是早已公认的。,13,2025/6/13 周五,2,、,C,基因区,C,基因区分为前,C,区和,C,区两部分。,C,区由,459,个核苷酸组成，编码产物为,183,个氨基酸残基组成的多肽序列，称为,C,蛋白（,HBcAg,）；,前,C,区由,87,个氨基酸残基组成，编码,29,个氨基酸残基组成的多肽称为前,C,蛋白。,整个,C,基因区编码,212,氨基酸残基组成的多肽称为乙型肝炎病毒,e,抗原（,HBeAg,）。,1,、,S,基因区,S,基因,区分为：前,S1,区,、前,S2,区和,S,区,。编码外膜蛋白，前,S,区与病毒的嗜肝性有关。,S,区和前,S2,区基因长度是固定的，前,S1,区基因在不同亚型间有所差别，其氨基酸残基数在,108119,范围。,14,2025/6/13 周五,3,、,P,基因区：,是,HBV DNA,中最大的一个,ORF,，与其他基因区均有重叠，编码产物是乙型肝炎病毒,DNA,的多聚酶蛋白,(HBV DNAP,）。,P,基因区中某些核苷酸也会发生点突变，造成,HBV DNA,多聚酶的表达水平减少或完全阻断，通过研究,P,基因的结构与功能，可进一步探索抗,HBV,治疗的新方法。,4,、,X,基因区：,是,HBV DNA,中最小的一个,ORF,，,编码产物为,x,蛋白,(HBxAg),。,HBxAg,的氨基酸残基数在,145154,之间，功能尚未明确，可能是一种反式激活因子，与病毒基因组的表达调控及,HBV DNA,的整合,有关。,x,蛋白所诱生的抗体常见于原发肝细胞癌患者体内。,15,2025/6/13 周五,(,二,),乙型肝炎病毒基因组编码产物,pre-S1 pre-S1,蛋白,pre-S2 pre-S2,蛋白,S HBsAg,pre-C HBeAg,C HBcAg,P DNAP,X HBxAg,HBV DNA,主要有四个开放阅读码框架，具有强大的蛋白质编码功能。,HBV,的结构蛋白包括,S,蛋白、,C,蛋白、,P,蛋白和,X,蛋白四大类，这些,HBV,的结构蛋白不仅与乙肝病毒颗粒的装配有关，还与,HBV,基因组复制与表达的调控有关，而且有关,S,基因区表达产物的研究，对新型乙型肝炎疫苗的研制具有极为重要的意义。,16,2025/6/13 周五,1,、外膜蛋白,编码,HBV,外膜蛋白的基因有三个起始密码子,(AUG),，一个终止密码，编码产物有三种。,由于,PreS1,在不同的亚型中有差异，所以不同亚型外膜大蛋白的肽链长度不等。,外膜主蛋白即,S,蛋白,由,S,基因编码，,因其分子量小亦称,小蛋白,。是,HBsAg,的主要成分,，是含,226,个残基 的一种疏水性蛋白，是病毒包膜蛋白及亚单位的主要成分。,HBsAg,是机体受,HBV,感染的主要标志之一。,17,2025/6/13 周五,外膜中蛋白,由前,S2,蛋白和小蛋白组成,。前,S2,基因编码的,55,个氨基酸通常是亲水性的，具有比,S,蛋白更强的免疫原性，对,前,S2,蛋白免疫原性的研究可为制备高效价乙肝疫苗提供依据。,外膜大蛋白,是前,S1,基因编码的,由,389400,个氨基酸残基组成的一种蛋白质，其分子量是,S,基因区编码产物中最大的蛋白。外膜大蛋白有,两种不同的形式，,糖基化的,gp42,和非糖基化的,p39,，分子量分别是,42kDa,和,39kDa,。,一个完整的病毒体含,300400,个,S,蛋白分子，,4080,个中蛋白和大蛋白分子。在病毒的非复制期几乎含的都是,S,蛋白，中蛋白小于,1%,，无大蛋白；而在病毒的复制期,S,蛋白与中蛋白比例为,10,：,1,，大蛋白少于是,1/20,。,18,2025/6/13 周五,2,、核心区蛋白,HBV DNA,的核心基因区编码,HBcAg,和,HBeAg,。,HBcAg,蛋白由,C,基因开始编码的,183,个氨基酸残基组成：,HBcAg,主要定位于感染,细胞核内,，而且,HBcAg,外面包裹,HBsAg,，故不易游离在血循环中，因此也就,不易从患者血清中检出,，但,HBcAg,也可在肝细胞膜表面表达。,HBcAg,中含有,T,细胞表位，是特异性细胞毒性,T,淋巴细胞（,CTL,）识别主要靶抗原之一。,19,2025/6/13 周五,HBcAg,抗原性很强，能刺激机体产生,抗,HBc,，但无中和作用，如检出高效价抗,HBc,，特别是抗,HBc-IgM,则表示,HBV,在肝内处于,复制状态。,不同亚型的,HBcAg,长度不等，一般在,183214,个氨基酸。,HBcAg,相对保守，不同亚型,HBcAg,的变异率,6%,。,20,2025/6/13 周五,HBeAg,蛋白由前,-C,基因开始编码,（包括前,C,和,C,基因），由,212,个氨基酸残基组成：,HBeAg,为可溶性蛋白质，,游离于血中，可作为,HBV,复制及具有,强感染性的一个指标。,抗,-HBe,能与受染的肝细胞表面,HBeAg,结合，通过补体介导破坏受染的肝细胞，有一定的保护作用。,抗,-HBe,的出现是预后良好的征象。,21,2025/6/13 周五,前,-C,区是一个极易发生突变的区域。,前,-C,基因突变后，造成,HBeAg,的分泌水平下降或完全终止，形成,HBeAg,阴性的前,C,区突变株，使受感染的细胞不能被抗,-HBe,及相应的细胞免疫所识别而清除，从而使变异株在抗,-HBe,阳性的情况仍大量增殖。因此临床上将慢性乙型病毒感染,分为,HBeAg,阳性和,HBeAg,阴性两类患者,。对,HBeAg,阴性抗,-HBe,阳性的患者应注意监测血中病毒,DNA,。,22,2025/6/13 周五,3,、,DNA,多聚酶蛋白,HBV DNAP,是由,P,基因区编码的一种,依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶，,具有逆转录酶的活性。,HBV DNAP,存在,HBV,的核心中。,HBV DNAP,含,832845,个氨基酸残基，其一级结构富含组氨酸，是一种碱性蛋白，分子量约,90kDa,，需要在,2,阶镁离子存在条件下起作用。,根据,HBV DNAP,的基因功能，大体上将其分成,4,个功能性片段：从,HBV DNAP,的蛋白质,N-,端，,依次为引物酶区、隔离片区、逆转录酶区和,RNaseH,区。,HBV DNAP ORF,突变可造成,HBV,复制停止，提示在这一区域进行定点诱变的研究可为,HBV,治疗提供重要靶区。,23,2025/6/13 周五,4,、,X,蛋白,是由,X,基因编码的，也称,HBxAg,，只存在于哺乳动物嗜肝病毒中。,X,蛋白分子量为,17,.,5kDa,，其功能复杂多样。,通过反式调控激活细胞信号转导系统，能直接或间接地损害宿主细胞，导致肝细胞凋亡、坏死甚至癌变。,X,基因区也,存在广泛的碱基点替换突变和高频率的缺失突变，,突变后会抵制,X,蛋白的转录活性，使病毒复制水平下降，病毒蛋白合成减少，造成血清中各项标志物滴度下降甚至不能检出。,24,2025/6/13 周五,二、乙型肝炎病毒的分子生物学检验,（一）,乙型肝炎病毒核酸的检验,HBV DNA,是病毒复制和传染性的直接标志。定量检测,HBV DNA,对于判断病毒复制程度、传染性大小、抗病毒药物疗效等有重要意义。,25,2025/6/13 周五,1,普通,PCR,技术,传统,PCR,方法检测,HBV DNA,的灵敏度可以达到,ng,级水平，检测结果能直接反应,HBV,病毒的,复制程度，,为临床提供从分子水平上对病原体进行诊断提供依据。引物是,PCR,扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。,PCR,引物常根据其,S,、,C,、,P,和,X,基因中的高度保守序列来设计。,不足：不能进行准确的基因定量、重复性差、扩增产物间污染所到的假阳性多、强致癌物溴化乙啶的使用等。,26,2025/6/13 周五,2,荧光定量,PCR,技术,荧光定量,PCR,法的应用，可以在在进行,HBV DNA,检测的同时使其进行相对的量化，这对于乙肝患者体内,HBV,的复制及传染性有更直接的了解，能准确地反映,HBV DNA,的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。其特异性高，灵敏度可达,001fg,，检测范围为,2,.,5,10,2,2.5,10,9,copies/ml,。,27,2025/6/13 周五,3.,支链,DNA,技术,(bDNA,技术,),为一种与,PCR,不同的核酸探针杂交标记信号放大技术。,支链,DNA,是人工合成的带有许多侧链的,DNA,片段，在每个侧链上都有可以标记可被激发的标志物。用,bDNA,信号放大系统检测标本中的核酸时，靶核酸本身不被扩增，而是通过多个探针组成逐级信号放大，以检测核酸。,其基本原理为：,合成,3,个探针和,bDNA,分子，,3,个探针分别称为捕获探针、靶探针,1,和靶探针,2,。将捕获探针固相化在微孔板上，靶探针,1,可分别与待测核酸及固相化的探针杂交，而靶探针,2,可分别与待测核酸及,bDNA,杂交。这样，在杂交反应完成后，就形成了固相,捕获探针,靶探针,1,待测序列,靶探针,2,bDNA,复合物，借助酶的催化反应就能定量检测待测核酸的含量。,28,2025/6/13 周五,bDNA,技术的最大特点是对目标核酸直接进行检测，放大倍数确定，稳定性及重复性高，结果准确，技术操作中污染少。,该方法相对于,PCR,更易操作，只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性为单链，即可进行检测，不需事先将其纯化，因此也成为一种经典方法，受到广泛应用。,bDNA,技术的缺点就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水平检测。,第一代,bDNA,的检测范围在,3.5,10,5,5.7,10,7,copies/ml,之间，,第二代,bDNA,技术可达,2,10,5,copies/ml,，但仍不够高，从而限制了该方法的应用。,29,2025/6/13 周五,4.,核酸杂交,将待测标本点状加样于硝酸纤维素薄膜上，与标记的,HBV DNA,寡核苷酸探针进行斑点杂交，从而检测待测标本中是否存在,HBV DNA,，可定性或半定量，特异性好，但灵敏度不如,PCR,法。方法较烦琐，但不需特殊仪器设备。,液相杂交使用,125,I,标记核酸探针，与液相中的变性,DNA,杂交。然后采用,闪烁计数仪定量检测标记探针。,其检测限为,1,10,6,copies/ml,或,1-2pg/ml,。,30,2025/6/13 周五,5.,杂交捕获系统,该系统采用特异的,RNA,探针与靶分子,HBVDNA,杂交形成,RNA-DNA,杂交分子。多个,RNA-DNA,杂交分子被通用抗体捕获于微孔中，然后采用偶联有碱性磷酸酶的多克隆抗体检测杂交分子（该过程产生信号放大）。偶联的碱性磷酸酶采用发光底,1,，,2-,二二酮来检测。其信号可以被放大,3000,倍，检测限为,4.7,10,3,copies/ml,。,31,2025/6/13 周五,6.,基因芯片技术,根据乙型肝炎病毒高度保守的特异性基因序列设计寡核苷酸探针制备基因芯片，将待测病人的样本进行,PCR,扩增，,PCR,扩增的同时进行产物荧光标记，标记产物与基因芯片进行杂交，杂交结果经扫描仪读数并输出图像，然后通过计算机分析，从而检测病人是否有病毒感染、感染病毒的种类。,32,2025/6/13 周五,持续的,HBV DNA,抑制,组织学改善,和,ALT,正常化,防止肝病进展,为肝硬化、肝衰竭,或肝癌,减少死亡,或进行肝移植,首要治疗目标,最终的治疗目标,长期治疗,治疗目标,预防肝硬化,预防肝衰竭,预防肝癌,提高生存率,改善生活质量,（二）乙型肝炎病毒的耐药性分析,33,2025/6/13 周五,免疫调节与抑制病毒,抑制病毒,拉米夫定,阿德福韦,恩替卡韦,替比夫定,Tenofovir,Clevudine,免疫调节,干扰素,a,PEG,干扰素,a,CD8+,HBV DNA,34,2025/6/13 周五,免疫调节与抑制病毒药物的利与弊,免疫调节,优点,:,部分病人,HBsAg,消失,明确疗程,应答持久,缺点,:,注射,不良反应,禁忌证,抑制病毒,优点,:,快速抑制,HBV DNA,口服 方便,服药期间不良反应少,缺点,:,长期用药维持,病毒变异耐药,35,2025/6/13 周五,常用的抗,HBV,药物为核苷（酸）类似物，如拉米夫定、阿德福韦等，但在长期用药过程中，部分患者对药物产生了耐药性。,HBV,一旦出现耐药突变后肝功能恶化比例显著增高。随着服用拉米夫定时间的延长，患者的耐药性随之增加，服药,5,年的耐药性可高过约,69%,。因此，对乙型肝炎病毒的耐药性分析在指导临床用药和监测病情等方面都具有重要意义。,36,2025/6/13 周五,乙型肝炎病毒的耐药性产生重要原因是,HBV,本身是一种变异较高的病毒。,HBV,在复制过程中必须经过经过,RNA,中间体的逆转录过程中，由于,HBV DNA,多聚酶具有逆转录酶的性质，即缺乏严格的校正功能，使其自发突变率高达,10,5,。慢性,HBV,感染者由于长期抗病毒治疗也会诱发病毒基因变异。人体免疫应答或疫苗接种等压力下,HBV,也可发生突变。,突变引起病毒生物学特性的改变，使慢性,HBV,感染患者体内积累了大量基因序列突变的,HBV,株，从而导致,HBV,感染发病机制的变化、血清学检测指标的以改变,(,免疫逃逸,),及药物抗性等，给,HBV,感染的临床表现、诊断、预后及防治等方面带来一系列复杂的问题。,37,2025/6/13 周五,拉米夫,定,一,种能抑制乙型肝炎病毒复制的核苷类药物，其作用机制：,核苷,(,酸,),类似物与,HBV DNAP,的自然底物,(dNTP),竞争地与该酶结合,导致,HBV DNA,合成终止，达到抑制,HBV,复制的目的。所以与,HBV DNAP,结合能力的强弱决定了该类药物的疗效。,38,2025/6/13 周五,当,HBV DNAP,氨基酸序列发生改变并影响到其空间构象发生改变时，使,HBV DNAP,与核苷（酸）类似物的结合能力明显下降，于是就产生了对核苷酸类药物的耐药性，发生耐药现象。,在拉米夫定抗,HBV,感染治疗中，,HBV,发生变异最为常见，这些变异发生在,HBV DNAP,的基因区。,拉米夫定抗病毒治疗的靶点在,HBV DNAP,的逆转录酶区。,39,2025/6/13 周五,（三）乙型肝炎病毒的基因分型,对致病的乙型肝炎病毒可用不同的血清型或基因型进行描述。,根据,HBsAg,抗原性差异，将,HBV,分为,10,个血清型，其中主要的有,adr,、,adw,、,ayw,和,ayr,。血清型分布有明显的地区与种族差异，和国汉族以,adr,为主，,adw,次之。,根据,HBV,全核苷酸序列差异在,8%,或以上，或,S,基因序列差异在,4%,或以上的原则，可将,HBV,划分为不同的基因型，,目前已经发现,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,共,8,种基因型。不同基因型序列长度不同，主要是前,S1,区的不同。,40,2025/6/13 周五,HBV,血清型和基因型的地理分布,基因型,血清型,流行地区,A adw2,ayw1,欧洲西北部、美国、非洲中部,B adw2,ayw1,中国大陆、台湾、日本、印度尼,西亚、,越南,C adw2,adrq+,adrq-,ayr,中国大陆、台湾、日本、韩国、,越南、玻利尼西亚,D ayw2,ayw3,地中海地区、印度,E ayw4,非洲西部,F adw4q-,adw2,ayw4,非洲中部和南部、玻利尼西亚,G adw2,法国、美国,H,血清型和基因型有一定对应性，但不同血清型可为同一基因型，同一血清型又可分布于不同基因型,41,2025/6/13 周五,三、分子生物学检验的临床意义,1,、病毒载量检测,HBV DNA,的检测是判断,HBV,复制水平和传染性强弱的直接标志。定量检测,HBV DNA,，即对病毒载量进行测定，可用于确定被感染者病毒感染的程度,HBV DNA,拷贝数越高，病毒复制越活跃，传染性超强，肝脏损害和肝脏组织炎症反应可能越重。,病毒载量检测用于临床疗效监测：,HBV DNA,达,10,7,拷贝,/,毫升以上时，提示病毒复制活跃；,HBV DNA10,3,拷贝,/,毫升、,HBeAg,转为阴性、,ALT,正常的患者预后会相对较好。,42,2025/6/13 周五,2,、病毒分型检测,HBV,基因型与,HBV,流行病学特点、,HBV,标志物的表达、致病性、乙型肝炎的病程、转归及对药物的敏感性有关。,HBV,基因分型对抗病毒疗效的监测意义。,不同基因型,对抗病毒药物的效果存在一定差异,用拉米夫定抗病毒治疗时，基因型,B,比基因型,C,有更好的应答：,用普通,IFN-a,治疗时，基因型,B,比基因型,C,对干扰素治疗的应答率高。,43,2025/6/13 周五,HBV,基因型与基因突变之间存在一定关联。,不同的基因型易发生突变的类型可能不同。,基因型,B,以,YVDD,变异为主；基因型,C,以,YIDD,变异为主。,HBV,基因型与患者病情的转归及患者的年龄也有关系。,C,基因型感染者较,B,型感染者具有更高的,HBeAg,阳性率，,C,基因型对肝的损伤比,B,基因型严重。,A,基因型与肝脏的慢性炎症相关。,D,基因型与急性自限性肝炎相关。,C,基因型比,B,基因型更容易发展成为肝硬化，,C,基因型在高年龄段的,HCC,患者中比例高，,B,基因型在低年龄，尤其在,35,岁以下,HCC,患者比例较高。,44,2025/6/13 周五,我国流行的主要是,A,、,B,、,C,、,D,四种,HBV,基因型，另有混合型。,四种,HBV,基因型在中国地域分布的主要概况,HBV,基因型 主要分布地域,A,基因型 仅见于少数地区,(,广西壮族自治区,),B,基因型 长江以南,C,基因型 长江以北,D,基因型 少数民族较多的地区,(,西藏、新疆、宁夏等,),45,2025/6/13 周五,3,、耐药突变检测,HBV,耐药性的检测在临床上主要是对,HBV DNA,聚合酶,P,基因的检测，即鉴别是野生型,(Y,M,DD),还是存在耐药突变型,(Y,V,DD,或,Y,I,DD),检测结果可为抗病毒药物治疗中,HBV,耐药性产生提供依据。拉米夫定耐药突变主要集中在,552,位氨基酸的,Y,M,DD,Y,V,DD/Y,I,DD,，并且,M552V,是拉米夫定耐药突变的主要形式，可导致病毒复制反弹，,HBV DNA,及,ALT,水平升高。目前,YMDD,的检测技术虽多,但尚无,”,金标准,”,.,552,位的蛋氨酸被缬氨酸所替代（,M552V,）,552,位的蛋氨酸被异亮氨酸所替代（,M552I,）,46,2025/6/13 周五,HBV YMDD,变异直接测序结果图谱,47,2025/6/13 周五,PCR-RFLP,检测,HBV YMDD,变异,48,2025/6/13 周五,DNA,芯片技术诊断,HBV YMDD,变异,49,2025/6/13 周五,另外，还有一部分患者,HBV,前,C,区,1896,位点（,G,1896,A,）发生突变，使编码色氨酸的密码子,T,G,G,突变为终止密码子,T,A,G,，导致,HBeAg,的全成终止，使乙肝患者对干扰素的完全应答率下降，也是造成干扰素产生耐药性重要原因之一。,在慢性,HBV,感染患者的长期抗病毒治疗中，应需要特别注意对,HBV,耐药突变基因的检测，及时了解患者体内,HBV,是否发生抗病毒药物的耐药突变，对指导临床合理选择抗病毒药物、调整最佳治疗方案、监测抗病毒药物的药效及实现个体化诊治等方面都有临床指导意义。,50,2025/6/13 周五,第三节,丙型肝炎病毒的分子生物学检验,51,2025/6/13 周五,丙型肝炎病毒,(HCV),属黄病毒科。目前发现约,90%,的输血后非甲非乙型肝炎和,7080%,的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由,HCV,感染所致。部分,HCV,感染者不出现临床症状，但有,50%,会发展成为慢性，且易致肝硬化和肝癌。,52,2025/6/13 周五,HCV,主要通过血或血制品传染,(,输血、注射毒品、使用不干净的器械刺青和穿孔,),，或母婴和家庭内接触而获得。除了血液传染之外，,HCV,也可能会经由性行为与垂直传染来传播，在,HCV,感染者精液与阴道的分泌物中可以发现,HCV,病毒的存在，目前也有一些报告已经显示性行为是可以传播,HCV,的。至今为止仍有不少感染者是由于不明原因而感染，所以似乎还有未知的传染途径存在。,53,2025/6/13 周五,（一）丙型肝炎病毒基因组结构,HCV,呈球型颗粒，直径约,50nm,，有脂质包膜基因组为单链正链,RNA,病毒，链长约,9.5kb,。整个基因组只有一个,ORF,，编码,30113010,个氨基酸组成的聚蛋白前体，该蛋白前体在病毒蛋白酶和宿主信号肽酶作用下，裂解为病毒的结构蛋白和非结构蛋白。,54,2025/6/13 周五,在,HCV,基因组,中,5,端有一个长度和序列非常稳定的非编码区（,UTR,）,，由,341,个核苷酸组成，形成,4,个二级结构域，,为病毒复制和翻译所必需,。此区是整个基因组中最保守的区域,所以常选择此区域的基因序列作为基因扩增的靶序列，可检出已知的所有,HCV,基因型。,3,端,UTR,包括,3,个结构域：靠近,5,端为基因型特异的多变区；居中部分为,1,个多聚,U,区域（,poly U,），含有,5062,个核苷靶（不同基因型长度不等），,对病毒,RNA,复制至关重要；,3,端尾部为高度保守的发夹样结构，称为,X-tail,。通过定点突变破坏这一结构会导致,RNA,病毒复制的显著降低,5,端,和,3,端,UTR,之间的,ORF,分成,9,个区域：其中,NS5b,区域在不同型,HCV,中同源性较低，可作为,HCV,分型依据。,55,2025/6/13 周五,（二）丙型肝炎病毒基因组编码产物,1,、结构蛋白,结构蛋白包括,核心蛋白,和,包膜糖蛋白,。它们分别是由,C,区,、,E1,和,E2/NS1,区,编码而来。,E2/NS1,区产物的,N,端的高变区,（,HVR,）在机体内的变异程度可能与初始感染剂量、病毒复制效率、感染期限、宿主免疫反应、感染物的异质性有关。,HVR,的变异程度可预测患者对干扰素的疗效。,HCV,利用包膜糖蛋白的抗原变异及机体免疫选择压力，产生出逃避株，长期存留在患者体内造成感染慢性化。,56,2025/6/13 周五,2,、非结构蛋白,NS2,蛋白疏水性很强，与细胞膜相伴随。,NS3,蛋白是多功能蛋白，,N,端有蛋白酶活性，,C,端有解旋酶活性，,NS3,蛋白有强免疫原性，且在肝细胞恶性转化中也起重要作用。,NS4,蛋白质,包含,NS4a,和,NS4b,。,NS4a,能辅助,NS3,蛋白酶活性的表达，,NS4b,为疏水性膜相关蛋白，可能在,HCV,复制酶复合体的装配中起作用。,57,2025/6/13 周五,可用于检测患者血清中的,HCV,抗体,NS5,蛋白可能为蛋白质，也含,NS5a,和,NS5b,两部分。,NS5a,蛋白是,HCV,复制酶复合体的成分之一，具有多种功能，可与宿主蛋白相互作用，使体内细胞环境更适宜,HCV,的复制，促进,HCV RNA,的复制。,NS5b,为膜结合型磷蛋白，有,RNA,依赖的,RNA,聚合酶活性，参与病毒,RNA,的合成。可能与,HCV,感染所致的肝细胞肿瘤发生有关。,58,2025/6/13 周五,二、丙型肝炎病毒的分子生物学检验,（一）,丙型肝炎病毒的核酸检测,肝组织内,HCV RNA,检测可应用斑点核酸杂交技术，血清中,HCV RNA,检测多采用,PCR,、核酸杂交、,bDNA,、基因芯片、转录介导的扩增系统等技术。,59,2025/6/13 周五,（二）丙型肝炎病毒的基因分型,1,、,HCV,基因型种类,根据全世界不同地区分离的,HCV,不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，,HCV,呈现三个水平的遗传变异性：,型：,各型核酸序列之间相差,31%34%,；,亚型：,序列之间相差,20%23%,；,准病毒株：,序列之间相差,1%10%,；,差异最大的序列集中在,E1,和,E2,区，而,C,基因和一些非结构蛋白基因则相对保守。,5UTR,区的序列最保守，种系变化程度及进化率很低，可用于区分主要基因型；,NS5b,区变异较大，易于区分不同病毒株，常被选作亚型区分依据。,根据基因序列的差异，将,HCV,分为,6,种基因型及,100,多个亚型。,60,2025/6/13 周五,2,、,HCV,基因分型常用方法,目前,HCV,基因分型的常用方法有：,（,1,）测序分析法,可对,HCV,基因组的,E1,、,NS5b,、,C,区直接进行测序和进化树分析，是,HCV,基因分型的,“,金标准,”,。,（,2,）,PCR-RFLP,（,3,）实时荧光,PCR,（,4,）基因型特异性引物扩增法,（,5,）型,特异性核酸探针杂交法,（,6,）基因分型检测芯片,61,2025/6/13 周五,三、分子生物学检验的临床意义,（,一）检测,HCV,抗体,用基因重组克隆表达的,HCV,蛋白质或以合成的多肽如核心蛋白,C22,及,NS3,、,NS4,、,NS5,区等非结构蛋白作为抗原，通过,ELISA,法、放射免疫法检测抗,HCV IgG,或,IgM,。若抗,HCV,IgM,阳性可对,HCV,感染进行早期诊断，检出率可达,90%,以上。,（二）检测,HCV RNA,定性检测,HCV RNA,的存在是,HCV,感染的确证标志，在,HCV,感染的第一周内就可以检测出,HCV RNA,，解决了免疫学检测的,“,窗口期,”,问题。,定量检测,HCV RNA,拷贝数，对动态监测,HCV,的传染性、病毒复制情况、抗病毒药物疗效及判断患者预后等有重要临床价值。,62,2025/6/13 周五,（二）检测,HCV,基因型,1,、分布特征及传播途径,HCV1,、,2,、,3,基因型在全球范围内广泛分布，,HCV4,型主要分布在北非和中东国家，,HCV5,型主要分布于南非，,HCV6,型主要流行于东南亚。,1a,1b,2b,3a,5a,4,4,1a,1b 2a,2b,3a,1a,1b 2a,2b,2c,3a,1b,3a,3b,1b,6,2a,1b,1b,3a,63,2025/6/13 周五,HCV1b,型主要经血液传播，而,HCV1a,、,3a,主要经静脉注射毒品传播，这是目前,HCV,传播的主要传播途径，占新发病例的,70%,左右。,我国流行的主要,HCV,基因型及亚型有,1b,、,2a,、,3a,、,3b,及,6a,。其中，,2,型为主。目前诊断,2,型的致病性强，复制快，复制产生的病毒量多，症状较重，较难治疗。,2,、判断病情,在,HCV,感染的整个过程中，宿主内,HCV,致病性呈现明显的生物学差异。有些感染,HCV,后短时间内就出现严重的并发症，如肝纤维化和肝癌；有些即使感染的时间,很久,却无并发症。目前多数研究认为：,HCV,基因型是主要影响因素。在慢性,HCV,感染患者中，与其他基因型相比，,1b,型感染与更严重的肝脏疾病、更迅速的疾病恶化相关。因此，,HCV 1b,基因型可作为与较严重的,HCV,相关性肝脏疾病的标志物。,64,2025/6/13 周五,3,、预测疗效,HCV1b,及,1a,基因型比,HCV2,型或,3,型对干扰素治疗的,SVR,（,持续病毒学应答）,要差。,如,HCV2,型感染患者,60%70%,在干扰素治疗,6,个月后有应答；而,HCV1,型感染患者只有,10%15%,有应答反应。,这种差异在干扰素治疗的持续性应答方面经常出现，且不受肝脏组织学特点或治疗前,HCV,水平的影响。,检测,HCV,基因型将有助于,HCV,感染者的临床诊断并预测治疗效果，也能为调整用药剂量及治疗时间、制订个体化抗病毒治疗方案提供指导。,治疗结束时病毒学应答,(ETR),在治疗末期检测不出,HCV RNA(HCV,基因型,2/3,型，治疗,24,周；,HCV,基因型,1,型，治疗,48,周）,持久性病毒学应答,(SVR),在随访期结束时检测不出,HCV RNA(,治疗结束后,24,周）,无应答,在治疗结束时仍能检测出,HCV RNA,反跳,在治疗期间检测不出,HCV RNA,，但是后来又检测出,HCV RNA,复发,在治疗结束时,HCV RNA,阴性，但是在随访期,HCV RNA,阳性,65,2025/6/13 周五,第四节,人乳头瘤病毒的分子生物学检验,66,2025/6/13 周五,人乳头瘤病毒（,HPV,）是一种嗜上皮性病毒，具有高度的组织和宿主特异性及将正常细胞永生化能力。可致人类皮肤黏膜异常增生，引起良性肿瘤和疣，如寻常疣、尖锐湿疣、,乳头状瘤；或导致癌变，如阴道癌、宫颈癌等，是一种常见的性传播性疾病。,电镜下,HPV,HPV,是一种无包膜的,双链闭环,的小型,DNA,病毒。,球形，直径52-55,nm,。,由,DNA,核心和蛋白衣壳组成。衣壳由主要衣壳蛋白,(L1),和次要衣壳蛋白,(L2),组成。,67,2025/6/13 周五,一、人乳头瘤病毒的基因组结构特征,(,一,),病毒人乳头瘤病毒基因组结构,HPV,基因组可分为三个区段：早期区（,E,）、晚期区（,L,）及长控制区（,LCR,）或称上游调节区（,URR,）或非编码区（,NCR,）。,早期区,长约,4Kb,，分为,E1E8,开放阅读框，其中,E3,和,E8,不是所有病毒基因组都有，尚未发现它们为病毒蛋白编码。,晚期区,约,3000bp,，有两个主要,ORF,，分别称为,L1,，,L2,，与,E,区的转录方向一致。,长控制区,位于,E,区和,L,区之间，长约,1000bp,。,不同的,HPV,亚型的,L,区,DNA,序列变异很大，为不同亚型分型的重要标准之一。,68,2025/6/13 周五,(,二,),病毒人乳头瘤病毒基因组编码产物,早期区主要编码与病毒复制、转录、调控和细胞转化有关的蛋白。,E1,、,E2,、,E5,、,E6,和,E7,在上皮分化的早期阶段表达。,其中,E6,、,E7,是潜在的致癌基因,，在持续性,HPV,感染中高水平表达，分别编码含,158,和,98,个氨基酸残基的病毒原癌蛋白，两者共同存在,Cys-x-x-Cys,基序，具有锌指结构，可分别结合抑癌基因产物,P53,和,RB,蛋白，导致细胞周期失控、细胞增殖和凋亡失调，增加特异性致癌作用。,Cys,；半胱氨酸,69,2025/6/13 周五,E2,负性调节,E6,和,E7,，,保持细胞的分化成熟。,E4,可在上皮分化的整个过程中表达,，能溶解细胞骨架蛋白，出现挖空细胞改变。,L1,和,L2,在上皮分化终末阶段表达,，分别编