资源描述
单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构,(,补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有启动子，下游有终止子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因工程的基本操作程序,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞,4,、目的基因的检测与鉴定,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,一、目的基因的获取,目的基因,供体生物细胞,取出,DNA,限制酶剪去多余部分,限制酶,1.,目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,2,、获取目的基因的常用方法,（,1,）从基因文库中获取,（,2,）利用,PCR,技术扩增,（,3,）人工合成,1.,概念：,基因文库,（gene library）,基因组文库,部分基因文库,（如,cDNA,文库）,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为,基因文库,(gene library),基因组文库,:,基因文库中包含了,一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库,.,部分基因文库,:,基因文库中包含了,一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库,.,基因组文库与部分基因文库的关系,提取某种生物的全部,DNA,用适当的限制酶切,一定大小的,DNA,片段,将,DNA,片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,2,基因文库的构建方法之一,（,1,）直接分离法,(,鸟枪法,),某种生物的单链,mRNA,单链互补,DNA,双链,cDNA,片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA,文库,逆转录酶,DNA,聚合酶,3,.,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因,的,翻译产物蛋白质,等特性。,4.,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过,PCR,方式从含有该基因的生物的,DNA,中，直接获得，也可以通过反转录，用,PCR,方式从,mRNA,中获得，不一定要构建基因文库。,但如果,所需要的目的基因的序列完全不知,，或,只知道目的基因序列的一段,，或,想从一种生物体内获得许多基因,，或者,想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同,，或者,想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同,，或者,想得到一种生物的全基因组序列,，往往就需要构建基因文库。,2,.,利用PCR技术扩增目的基因,PCR,多,聚,酶,链式反应,是一项生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR,技术,原理：,前提：,原料,方式,PCR,扩增仪,DNA,复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以,_,方式扩增，,即,_,（,n,为扩增循环的次数）,指数,2,n,模板,DNA,；,DNA,引物；,四种脱氧核苷酸；,热稳定,DNA,聚合酶（,Taq,酶）；离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链DNA解链成为单链DNA,退火：,冷却至,55,60,引物与,部分,模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,变性,退火,延伸,2,、具体过程,3,.,人工合成,根据已知的氨基酸序列合成,DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二.,基因表达载体的构建核心,质粒,DNA,分子,一个,切口,两个,黏性末端,两个,切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,目的：,组成：,1,、使目的基因在,受体细胞,中稳定存在，且可以遗传给下一代，,2,、使目的基因能够,表达,和,发挥作用,。,它们各自的作用是什么,?,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,+,复制原点,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，,能终止,mRNA,的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,三、,将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞,染色体的,DNA,上,。,过程,：,（,2,）,基因枪法,（,3,）,花粉管通道法,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用,Ca,2+,处理细胞,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收,DNA,分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上,是否插入了目的基因,(,关键步骤,),首先取出转基因生物的基因组DNA,用含,目的基因的DNA片段,用放射性同位素等作标记,以此做,探针,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（,1,）,方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,知识延伸,DNA,分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链,DNA,解开，把单股的,DNA,小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的,DNA,中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的,DNA,或基因。,归纳步骤,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因,是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因,是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,归纳步骤,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,
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