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临床检验仪器学教案
第一章 概 论
.基本要求
了 解
() 学习《临床检验仪器学》课程的目的
() 如何选用和维护临床检验仪器
() 临床检验仪器的分类
() 临床检验仪器的发展趋势
熟 悉
() 临床检验仪器的特点
() 临床检验仪器的主要部件
掌 握
临床检验仪器常用的性能指标
重点难点
重 点
如何选用和维护临床检验仪器
难 点
() 临床检验仪器常用的性能指标
() 临床检验仪器的主要部件
.讲授学时
建议学时
.内容提要
学习《临床检验仪器》课程的目的
    检验医学是一门涉及范围广泛的多专业交叉性学科。随着现代医学的不断发展，检验医学已经不再是单纯地辅助临床诊断。各种检验项目的检测结果为临床医生和患者提供了真实可靠的实验室数据，对疾病的诊断、治疗、病情监测、预后判断和健康评价发挥着重要作用。培养和提高医学院校相关专业的各层次学生、实验室工作人员熟练掌握和使用各类现代化检验仪器，使之在疾病的诊断和治疗中发挥最佳的效能，成为相当急迫，重要的任务。
    使各层次学生和相关工作人员了解和掌握名目繁多的检验仪器的性能质量，掌握各种常用检验仪器的工作原理、分类结构、技术指标、使用方法、常见故障的排除、临床检验仪器中的计算机技术，关注其发展趋势及特点，以使有限的仪器得到综合应用，为他们更好地从事临床检验工作打下坚实的基础，这就是学习本课程的目的。
临床检验仪器的特点、分类和常用性能指标
4.2.1 临床检验仪器的特点
    临床检验仪器多是集光、机、电于一体的仪器，使用部件种类繁多。尤其是随着仪器自动化程度的提高和仪器的自动化、智能化，仪器功能的不断增强，各种自动检测、自动控制功能的增加，使临床检验仪器结构更加复杂。一般来说，临床检验仪器具有的特点有：涉及的技术领域广、结构复杂、技术先进、精度高、对使用环境要求严格等。
4.2.2 临床检验仪器的分类
（）分离分析检验仪器 低速离心机，高速离心机，超速离心机；气相色谱仪，高效液相色谱仪；等电聚焦电泳仪，高效毛细管电泳仪。
（）光谱分析检验仪器 紫外─可见分光光度计；荧光分析仪；原子吸收光谱仪，原子发射光谱仪，荧光光谱仪。
（）目视检验仪器 普通生物显微镜，荧光显微镜，紫外线显微镜，偏光显微镜，相衬显微镜，透射电子显微镜，扫描电子显微镜。
（）细胞及分子生物学检验仪器 培养箱、生物安全柜、流式细胞仪、基因扩增仪、全自动测序仪和蛋白质自动测序仪等。
（）临床检验常规仪器 血细胞分析仪，血液凝固分析仪，血沉分析仪，血液流变学分析仪；尿液分析仪，尿沉渣分析仪；样品自动处理系统，半自动生化分析仪，全自动生化分析仪；电解质分析仪，血气酸碱分析仪；自动血培养仪，微生物快速检测仪；酶免疫分析仪，发光免疫分析仪，γ计数器，微量蛋白比浊仪，磁分离酶联免疫测定仪等。
（）其它临床检验仪器（包括及时检测仪器和实验室自动化系统）。
4.2.3 临床检验仪器常用的性能指标
    一个优良的检验仪器应具有：灵敏度、分辨率和精度高，噪音和误差小，可靠性、稳定性和重复性好，响应时间短，测量范围、示值范围、频率响应范围和线性范围宽等性能指标。
临床检验仪器的主要部件、维护和选用标准
4.3.1 临床检验仪器的主要部件
    临床检验仪器的主要部件包括: 取样(或加样)装置、预处理系统、分离装置、检测器、信号处理系统、显示装置、补偿装置、辅助装置、样品前处理系统等。
4.3.2 临床检验仪器的维护
    检验仪器维护工作的目的是减少或避免偶然性故障的发生，延缓必然性故障的发生，并确保其性能的稳定和可靠。仪器的维护工作是一项贯穿整个检验过程的长期工作，必须根据各仪器的特点、结构和使用过程，针对容易出现故障的环节，制定出具体的维护保养措施，由专人负责执行。
（）操作人员应认真阅读仪器操作说明书，正确使用仪器；
（）检验仪器对使用环境有很高的要求，应让仪器始终处于清洁、干燥并符合要求的温、湿度环境中，要确保精密仪器远离腐蚀源。
（）要有良好稳定的供电系统，这对于保持检验仪器的精度和性能极为重要。
（）应当按照仪器说明书提供的方法和标准(图谱)对仪器定期进行校验，同时应该认真做好仪器的各项工作记录。
4.3.3 临床检验仪器的选用标准
    选用临床检验仪器应要求仪器的精度等级高、应用范围广、检测范围宽、稳定性好、灵敏度高、噪音小、响应时间短等；要求仪器的检测速度快、检测参数多，结果准确可靠，可靠性好；用户操作程序界面全中文显示，操作简便，快捷；有国内生产的配套试剂盒供应；仪器不失效的性能、寿命、可维修性和仪器的保存性能好，如仪器的装配合理、材料先进、采用标准件及同类产品通用零部件的程度高，售后维修服务好；能充分体现高效益、低成本等。
临床检验仪器的进展和发展趋势
4.4.1 临床检验仪器的进展
    从十七世纪末,荷兰人在诊断中创造了显微镜开始至今，临床检验仪器的进展经历了几个关键性的阶段。其学科的发展一直及科学技术的进步密切相关，尤其是电子技术、计算机技术和生物芯片技术对其有着巨大的影响。随着医学基础学科和生命学科的迅猛发展，许多新技术、新方法在临床检验中的广泛应用，将使得临床检验仪器的发展更加日新月异。
4.4.2 临床检验仪器的发展趋势
（）由计算机技术和通信技术相结合而发展的计算机网络，已渗透到临床检验实验室中，形成了多用户共享高精度、高速度、多功能、高可靠性的检验仪器。
（）利用物理学的新效应和高新技术及其成就开发新型检验仪器和新型高灵敏度、高稳定性、强抗干扰能力的新型传感器技术和纳米检测技术，研制新型的、高精度、高分辨率的检验仪器。
（）模块式设计形成一个高质量多功能的检验系统，实现了一机多用。
（）分子生物学技术已成为核心技术和前导技术逐渐运用到检验设备的研发中去，影响着检验仪器发展的历程。
（）专家系统技术更趋完善，使临床检验仪器具有更高级的智能。
（）仪器更机器人化、更个性化。
（）自动化水平更高。
（）检验结果标准化。
（）仪器小型便携化。
第二章 显微镜技术和显微镜

.基本要求
了 解
() 了解显微镜技术的产生和发展现状
() 了解光学显微镜的常见故障及其排除方法
熟 悉
() 熟悉临床常见显微镜的临床应用
() 熟悉光学显微镜的维护、调试及使用方法
() 熟悉扫描隧道显微镜的基本原理及特点
() 熟悉超高压电子显微镜的原理和特点
() 熟悉电子显微镜的临床应用
掌 握
() 掌握光学显微镜的光学参数、基本原理、结构和关键部件
() 掌握常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件
() 掌握电子显微镜的类型和组成
() 掌握透射和扫描电子显微镜的基本原理及特点。
重点难点
重 点
() 光学显微镜的光学参数、基本原理、结构和关键部件
() 临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件
() 临床常用显微镜的性能、用途
() 光学显微镜的调试及使用方法
() 电子显微镜的类型和组成
() 透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点
难点
() 临床常用显微镜的基本原理、结构和特殊部件
() 临床常用显微镜的性能、用途
() 透射电子显微镜、扫描电子显微镜、扫描隧道显微镜的基本原理及特点
.讲授学时
建议学时
.内容提要
光学显微镜
4.1.1 光学显微镜的工作原理
    光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，供人们提取物质微细结构信息的光学仪器。显微镜是由两组会聚透镜组成的光学折射成像系统。把焦距较短、靠近观察物、成实像的透镜组称为物镜（ ），而焦距较长，靠近眼睛、成虚像的透镜组称为目镜（ ）。而相对于物镜的成像条件及最后二次成像于观察者的明视距离等条件的满足是通过仪器的机械调焦系统来实现的。被观察物体位于物镜的前方，被物镜作第一级放大后成一倒立的实像，然后此实像再被目镜作第二级放大， 得到最大放大效果的倒立的虚像，位于人眼的明视距离处。
4.1.2 光学显微镜的基本结构
    光学显微镜的基本结构包括光学系统和机械系统两大部分。光学系统是显微镜的主体部分，有包括物镜、目镜、聚光镜及反光镜等组成的照明装置。机械系统是为了保证光学系统的成像而配置的，包括调焦系统、载物台和物镜转换器等运动夹持部件以及底座、镜臂、镜筒等支持部件。一些特殊类型或高级显微镜还有一些附加装置。

图 显微镜基本结构示意图
4.1.3 光学显微镜的性能参数
放大率:显微镜的放大率()或称放大倍数是指显微镜经多次成像后最终所成(放大的)像的大小相对于原物体大小的比值。
数值孔径：数值孔径( )又叫镜口率，是物体及物镜间媒质的折射率及物镜孔径角的一半(β)正弦值的乘积，通常缩写为。
分辨率：显微镜的分辨率()又称为分辨本领( )，是指分辨物体微细结构的能力。
视野：视野( )又称视场()，是指通过显微镜所能看到标本所在空间的范围。
景深及焦长：景深( )又称焦点深度，是指在成一幅清晰像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离称“景深”。景物不动，像平面沿光轴前后移动的距离称“焦长”。
镜像亮度和清晰度：镜像亮度即显微镜的图像亮度的简称。镜像清晰度是指图像的轮廓清晰、衬度适中的程度。
工作距离：工作距离是指从物镜前表面中心到被观察标本间满足工作要求的距离范围，及物镜的数值孔径成反比。
4.1.4 像差和色差
．像差()：光学仪器不可能使物点发出而进入系统的所有光线都是沿着高斯光学的理想光路成像，从而导致成像在形状方面的缺陷。
球差( )：光轴上的点光源所发出的光锥入射到透镜的球折射面时，由于通过透镜边缘的光线不满足近轴光线的条件，因此不能和通过近轴曲面的光线会聚成一个理想的亮点，而是形成一个中间亮边缘逐渐模糊的弥散斑，这就是透镜的球面像差，简称为球差。
彗差( )：近光轴外的点光源发出的光束，经过透镜中央和边缘部分后在垂直于光轴的同一成像平面上也不能交于同一个像点。离光轴越近的像会聚越好，亮度越大，亮点越小。于是在成像平面上便形成一个顶端小而亮，远离光轴方向形成逐渐增宽且亮度减弱的模糊尾部，形如彗星，称为彗差。
像散()：远离光轴的物点发出的光，即使是以细光束成像也不可能会聚于一点，而是在像空间不同的成像面上或者成椭圆弥散斑，或者在特殊位置形成圆形弥散斑，甚至是形成两个垂直方向上的短亮线，这种成像缺陷称为像散。
场曲：一个平面的物体通过透镜成像后，虽然像平面上任意一点仍然是清晰的，但所成的像不再是一个平面，而成了一弯曲的面，这就是场曲。
畸变()：由于像平面上各处放大率不同引起的成像缺陷称为畸变 。畸变的原因是由于透镜边缘及透镜近轴的放大率不同而引起的。
．色差( )：是一种由白光或复色光经透镜成像时，会因各种色光存在着光程差而造成颜色不同、位置不重合、大小不一致的不同成像效果，从而造成像和物的较大失真。
光学显微镜的分类及其应用
4.2.1 双目生物显微镜
    双目显微镜( )的结构是利用一组复合棱镜把透过物镜后的光束分成强度相同的两束而形成两个中间像，分别再由左右目镜放大。来自物镜的光线经棱镜组分光成两束平行光束，进入目镜，双目显微镜必须满足分光后两束光的光程必须相同和两束光的光强度大小一致这两个基本要求。
4.2.2 荧光显微镜
    荧光显微镜利用物质的荧光性识别物质。荧光物质把入射的紫外线变为可见光，使荧光显微镜对可见光成像，故可以采用常规的物镜和目镜。当辐射波长在 以下时，应采用贵重的石英玻璃作载玻片，为避免试样上的灰尘或污点产生外来的荧光，被检试样必须十分清洁。为防止紫外线进入物镜，可以采用暗视场照明。荧光显微镜既可以观察固定的切片标本，而且可以进行活体染色观察。
4.2.3 相衬显微镜
    光线只有通过染色标本时其波长、振幅发生变化，人眼才能看见，但活细胞和未染色的标本由于光波长和振幅不发生变化，人眼看不到，但其相位有变化，因此利用光的干涉和衍射效应把透过标本不同区域的光波光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。可用来观察活细胞和未染色的标本。
4.2.4 倒置显微镜
    倒置显微镜( )的组成和普通显微镜一样，只不过物镜及照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。
4.2.5 暗视野显微镜
    暗视野显微镜（ ）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 ～的微粒子，分辨率可比普通显微镜高倍。它可用来观察小于μ物体的存在，这是其他光学显微镜观测不出来的。还可用来观察活细胞的运动，尤其是配合显微摄影技术，可记录一个细胞或细胞器的运动轨迹，借此可分析它的运动方向，乃至速度等。
4.2.6 紫外光显微镜
    使用紫外光源可以明显提高显微镜的分辨率，对于生物样品使用紫外光照明还具有独特的效果。生物细胞中的原生质对可见光几乎是不吸收的，而蛋白质和核酸等生物大分子对紫外光具有特殊的吸收作用。因此，可以使用紫外光显微镜（ ）研究单个细胞的组成及变化情况。
4.2.7 偏光显微镜
    偏光显微镜是利用光的偏振特性，对具有双折射性(即可以使一束入射光经折射后分成两束折射光)的晶体、液晶态物质进行观察和研究的重要光学仪器。
    偏光显微镜是在一般显微镜的基础上增添了使普通光转变成线偏振光和检测偏振光的装置或观察干涉图样的特殊透镜。即光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（一个偏振方向及起偏器垂直的起偏器）。
    偏光显微镜的载物台是可以旋转的。当载物台无样品时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线。而放入旋光性物质后，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。
    利用它可以清楚地观察到纤维丝、纺锤体、胶原、染色体、卵巢、骨骼、毛发、活细胞的结晶或液晶态的内含物、神经纤维、肌肉纤维、植物纤维等的细微结构，从而可以分析细胞、组织的变化过程。
4.2.8 激光扫描共聚焦显微镜
    激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像的基础上装有激光扫描装置，以单色激光作为光源，使样品被激发出荧光，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。
    共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，由于照明孔及检测孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明孔和检测孔，焦平面以外的点不会在检测孔处成像，这样就得到了标本清晰的光学切面图，克服了普通光镜图像模糊的缺点。
4.2.9 干涉相衬显微镜
    干涉相衬显微镜利用偏振光，有四个特殊的光学组件：偏振器、棱镜、滑行器和检偏器。
    偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。在聚光器中安装了石英棱镜，可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（和），二者成一小夹角。聚光器将两束光调整成及显微镜光轴平行的方向。最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起两束光发生光程差。在物镜的后焦面处安装了第二个棱镜(滑行器)，把两束光波合并成一束。这时两束光的偏振面（和）仍然存在。最后光束穿过第二个偏振装置(检偏器)，检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，使二者发生干涉。
    干涉相衬显微镜的优点是能显示结构的三维立体投影影像，及相衬显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强，产生类似于浮雕的效果。它使细胞的内部结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，因此适合应用于显微操作技术。
4.2.10 近场扫描光学显微镜
    近场显微镜的微探头是一个中空的、针状的、顶部小于，内孔直径为的玻璃微管，管壁镀铝膜，最终使光线只能从直径为（可见波长的左右）的内孔射入，微管的尾部接上十分灵敏的光量子探测器测量进入内孔的光量。这种技术的理论分辨率极限约。由于采用可见光对生物样品损害很少，而且既可以用在空气中（及电子显微镜必须在真空条件下相比要优越），又可以用在水中（及一般的光学显微镜相比也有优越性）。
    这种光学显微镜技术将对研究活体中的病毒和染色体等生物物质的结构和形态发挥作用。由于探测器对可见光是灵敏的，还可以对生物样品进行荧光分析。这种显微镜还能用来研究材料的表面性质。
电子显微镜
4.3.1 电子显微镜的基本结构
    电子显微镜主要由电子光学系统、真空系统、供电系统、机械系统和观察显示系统等几部分组成。电子光学系统主要由电子透镜和电子枪组成。
    真空系统主要由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空度指示的真空测量规等组成。
    供电系统包括高压电源、真空系统供电电源、透镜电源、辅助电源及安全保护系统的电源等。
    机械系统包括电镜座、标本室、磁屏蔽外壳、镜筒、制冷系统及控制工作台等。
    观察显示系统由荧光屏和照相室两部分组成。
4.3.2 电子显微镜的分类及其应用
. 透射电子显微镜：透射电子显微镜是以电子束透过样品经过聚焦及放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为～，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为～）。在生物医学中主要用于观察组织和细胞内的亚显微结构、蛋白质、核酸等大分子的形态结构及病毒的形态结构等，另外，透射电镜还是区分细胞凋亡及细胞坏死最可靠的方法。细菌细胞结构，鞭毛结构，放线菌的孢子结构及孢子表面装饰物立体形状等超微结构的观察，都需用透射电子显微镜。

图 透射电子显微镜的实体图
. 扫描电子显微镜：扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少及电子束入射角有关，也就是说及样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出及电子束同步的扫描图像。图像立体形象，反映了标本的表面结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。其分辨率一般为～，放大率为倍～ 倍，加速电压为～，的景深长、视野大、图像有立体感、样品制备简单、放大率范围广、能够观察较大样品的局部细微结构。扫描电镜可以观察到微观世界的立体形象, 它的图像是三维的逼真反映出样品表面结构的凹凸不平，如细菌的形态，鞭毛大小结构，放线菌的孢子表面装饰物等。在生物医学上，扫描电镜主要用来观察组织、细胞表面或断裂面的显微和亚显微结构及较大的颗粒性样品(～)的表面形态结构。
. 扫描隧道显微镜：扫描隧道显微镜是根据量子力学原理中的隧道效应和三维扫描而设计。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加电压（～），针尖及样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流，通过隧道电流获取显微图像，而不需要光源和透镜。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为～，纵向可达，已达原子量级的分辨率。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，可在真空、大气、常温等不同环境下工作，甚至可将样品浸在水和其它溶液中，不需要特别的制样技术。普通电镜只能观察制作好的固体标本。利用扫描隧道显微镜可直接观察生物大分子，如、和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列，特别适用于研究生物样品和在不同实验条件下对样品表面的评价。有两种工作方式，一种称为恒流扫描方式，即采用电子反馈线路控制隧道电流使其大小恒定，而用压电陶瓷管控制针尖的表面扫描路线保持间距不变，随着表面高低起伏而上下运动。另一种工作模式是恒高度工作，在对样品进行扫描过程中保持针尖的绝对高度不变；于是针尖及样品表面的局域距离将发生变化，隧道电流的大小也随着发生变化；通过计算机记录隧道电流的变化，并转换成图像信号显示出来，即得到了显微图像。
. 超高压电子显微镜：超高压电镜是指加速电压在以上的电子显微镜，目前是制作的超高压电子显微镜。普通的电子显微镜可用于观察纳米极薄的材料，而使用超高压电子显微镜就能进一步观察到更厚、更硬的材料。超高压电镜的优点是电子束穿透力强，可观察μ～μ的厚切片。因为是超高压，所以可减少由电子线的非弹性散射对材料的损害，因而能观察到接近自然状态的材料。电压越高，电子线的波长就越短，因而提高了电子显微镜的分辨率，可以观察活细胞超微结构的动态变化。
显微镜的维护、常见故障及排除
4.4.1 显微镜的使用
低倍镜的使用：
.对光：转动粗调节螺旋，降低载物台；旋转物镜转换器，使倍物镜头对准镜台孔；然后升高聚光镜，打开光圈，将反光镜的凹面对准光源，直至视野明亮为止。
.将要观察的切片放在载物台上，固定好，并将要观察的部位移至中央。
.调焦距：旋转粗调螺旋，升高载物台，至物镜距玻片约0.5cm时，再缓慢降低镜台，直到看清图像为止。
.调节两瞳孔间的距离：一边用双眼自目镜中观察，一边用双手握住两个目镜管，前后或左右移动，直到双眼看到一共同视野为止。
.为使右眼图像更清晰，可轻轻转动微调螺旋，欲使左眼图像清晰，需旋转镜管长度调节环。
高倍镜的使用：
    用低倍镜看清图像后，将要进一步放大的结构移至视野中央，一边从侧面观察，一边旋转物镜转换器，将高倍镜头对准镜台孔；升高聚光镜，将光线调节到最亮的程度；然后，稍微转动微调螺旋，即可观察到清晰的图像。
油镜的使用：
    用低倍镜看清图像后，将所要观察的结构移至视野中央，在标本所要观察的部位滴一滴镜油，旋转物镜转换器，将油镜头对准镜台孔，使油镜头下端及镜油接触，然后，轻轻转动微调螺旋，即可看清物像。使用油镜时，应把聚光镜的光圈充分开大。 用完油镜后，必须用擦镜纸蘸清洗剂，将镜头和玻片擦净。
4.4.2 显微镜的维护
.搬动显微镜时，应该用右手握镜臂,左手托镜座，平贴胸前，以防撞碰。切勿用一只手斜提，前后摇摆。
.每次使用显微镜前，要检查显微镜的主要部件有无缺损，发现问题，及时报告。使用时，要严格按操作程序，正确地缓慢移动有关机械部分。
.禁止拆卸显微镜的各个部件，更不允许及其它显微镜对换，以免安装不当影响观察效果。
.如镜头表面有灰尘，应该用擦镜纸擦，不允许用口吹、手指抹，或用其它纸、布擦。
.显微镜用完后，将倍镜头对准镜台孔，升高镜台，降下聚光器，打开光圈，盖好防尘罩，放回原处。
4.4.3 显微镜的常见故障及排除
4.4.4 显微镜拆装的注意事项
4.4.5 电子显微镜的维护
显微摄影术
4.5.1 成像原理及常用的装置
    从显微镜目镜射出的光线都会聚在“出射点”上，观察显微镜时人的眼睛就在这一位置。将感光胶片放于此位置并进行曝光，即可将此图像记录下来。图像的大小、放大倍率可由胶片及出射点间的距离进行调整，也可由目镜、物镜的倍数而加以改变。常用的显微摄影装置有两种：① 显微照相机；②照相显微镜。
4.5.2 感光材料及其暗室加工
    传统显微照相技术采用胶片作为记录介质，常用的胶片有黑白负片，彩色负片，彩色反转片几种。其中型者更为常用。感光胶片都是将照相乳剂涂在纤维素酯的片基上而组成的。黑白胶片的乳剂层为卤化银微晶体及明胶所组成。彩色胶片的乳剂层则由分别感受三原色或三原色补色的三层乳剂叠加在一起。每层乳剂仍由卤化银微晶体及明胶所组成，但各层卤化银微晶体上偶联有不同的成色剂，而于曝光后显影时及显影剂化合而形成各种原色或补色。其中的银粒则于显影后漂白除去，最后只留下透明的色素。
4.5.3 滤色镜的使用
. 黑白片显微摄影中滤色镜的使用：在使用黑白全色片进行显微摄影时标本上的各种颜色是以不同的灰度在胶片上显示的，而所拍的各种生物标本大都是经过染色处理的，所以反差不当的现象时有发生，不能获得满意的效果。这时，可在光源处加用滤色镜进行调整。
. 彩色片显微摄影中滤色镜的使用：彩色胶片分为彩色负片(可直接进行扩印或转制成幻灯片)和彩色反转片(可直接制成幻灯片，或转制成扩印片)。两者又都分为日光型及灯光型。日光型者适用于的照明条件(如自然光、氙灯、闪光灯等)，灯光型者适用于(型)(如卤素灯)，或(型)(如钨灯)的照明条件。
4.5.4 数码显微摄影技术
    数码相机置于相当于显微目镜出瞳处适当的部位，使其能清晰地拍摄显微图像并经过模数转换、图像压缩、将图像储存于外置存储卡。数字式显微摄影仪可根据不同需求配置计算机系统、打印机或电视机。并可通过接口及计算机连结用以拍摄、储存、编辑、传送图像；也可通过接口及电视机连结以显示所获得的图像。
第三章 离心技术及离心机

.基本要求
了 解
()离心技术及离心机的应用
()离心机的维护
()离心技术的应用实例
熟 悉
()离心机的工作原理
()离心力及相对离心力
()液体中的微粒在重力场中的分离（沉降速度、沉降时间、系数、沉降系数）
()液体中的微粒在离心力场中的沉降
()离心方法的选择
()离心机的转速、离心时间以及温度和值的确定
()离心机的使用
()离心机常见故障及排除方法
()离心方法和离心机的进展
掌 握
()常用的离心方法(差速离心法、密度梯度离心法、分析性超速离心法)
()离心机的分类方法
()低速、高速、超速及专用离心机使用范围
()离心机的结构（低速离心机、高速（冷冻）离心机、超速（冷冻）离心机）
()离心转头的分类、应用及功能
()离心机的主要技术参数及性能指标
重点难点
重 点
()常用的离心方法
()离心方法的选择
()离心机的结构（低速离心机、高速（冷冻）离心机、超速（冷冻）离心机）
难点
() 离心力及相对离心力
() 液体中的微粒在重力场中的分离
()液体中的微粒在离心力场中的沉降
() 分析性超速离心法
讲授学时
建议学时
内容提要
离心技术的基础理论
（） 离心机工作原理:
离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯生物样品的一种方法。悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而使溶液得以分离，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速、颗粒的质量、大小和密度。
当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用可使得悬浮的颗粒逐渐下沉，颗粒越重，下沉越快。微粒在重力场下移动的速度及微粒的大小、形态、密度、重力场的强度及液体的黏度有关。如红细胞颗粒，直径为数微米，可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。此外，物质在介质中沉降时还伴随有扩散现象（扩散是由于微粒的热运动而产生的质量迁移现象,主要是由于密度差引起的）。对小于几微米的微粒如病毒或蛋白质等，它们在溶液中成胶体或半胶体状态，仅仅利用重力是不可能观察到沉降过程的，因为颗粒越小沉降越慢，而扩散现象则越严重。扩散现象是不利于样品分离的，如果加大重力，就可能克服扩散现象的不利影响,实现生物大分子的分离。离心机就是利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，迫使液体中微粒克服扩散加快沉降速度，把样品中具有不同沉降系数和浮力密度的物质分离开。
（）离心力及相对离心力:
离心力： 当物体所受外力小于运动所需要的向心力时，物体将向远离圆心的方向运动。物体远离圆心运动的现象称为离心现象也叫离心运动。离心运动是由于向心力消失或不足而造成的。
相对离心力：是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“”。
（）液体中的微粒在重力场中的分离：
重力沉降：液体中的微粒受重力的作用，较重的微粒下沉及液体分开，这个现象称为重力沉降。
沉降速度： 指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。
沉降时间： 在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来需用多大转速及多长时间可达到目的的问题。如果转速已知，则需确定分离某粒子所需的时间即沉降时间。
（）液体中的微粒在重力场中的沉降：
①当离心机开动时，离心管绕离心转头的轴旋转，作圆周运动（见图），在离心管内的样品颗粒将同样运动；
②假如颗粒是处于真空中（即没有介质阻力时），颗粒会沿切线方向飞去，也就是当离心管由位转到位时，颗粒到达离心管底部位。对于离心管而言，样品颗粒由顶位移到了位，也就是由离心管顶部移到了底部，这及重力场中的由高处落到低处相似。这种颗粒在圆周运动时的切线运动称为离心沉降；
③ 颗粒作切线运动时将由于介质的摩擦阻力，使其在离心管中依图中虚线所示的曲线运动，当离心管由位转到位时，颗粒由顶位移到位。介质的阻力越大，颗粒在离心管中沉降速度越小，沉降的距离也越短。旋转速度越大，颗粒在离心管中沉降越快。

图 离心沉降示意图
常用的离心方法
()差速离心法(又称分步离心法) 采用不同的离心速度和离心时间,使沉降速度不同的颗粒分步离心的方法,称为差速离心。操作时,将含有两种不同颗粒的混悬液,以常速离心，使大的颗粒下沉，将上清液倾倒于另一离心管中，再加大离心力，离心一定时间，分离小的颗粒，反复多次分离，达到分离目的。差速离心主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。差速离心法的优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液及沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子；分离时间短、重复性高；样品处理量大。缺点是：分辨率有限、分离效果差，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。

图 差速离心法原理示意图
()密度梯度离心法(又称区带离心法) 该法又分为速率区带离心法和等密度区带离心法。样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心力下把颗粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优点是：具有很好的分辨率，分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适用范围广，既能分离沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点是：离心时间较长；需要制备梯度液；操作严格，不宜掌握。
①速率区带离心法：是根据分离的粒子在离心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，离心后具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内形成几条分开的样品区带，达到彼此分离的目的。临床常使用的分离液是、及蔗糖。把静脉血中单个核细胞分离出来，前一种分离液将血液中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）分为一个层，同时提出。而分离液将血中淋巴细胞和单核细胞分为二个梯度层，分别提取。后者分离效果优于前者，但操作繁琐。

图 速率区带离心示意图
②等密度区带离心法：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移动到它们密度恰好相等的位置上（即等密度点）形成区带，称为等密度区带离心法。等密度区带离心的有效分离取决于颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，及颗粒的大小和形状无关，但后两者决定着达到平衡的速率、时间和区带的宽度。

图 等密度区带离心示意图
（)分析性超速离心法
①分析型超速离心机的工作原理：分析型超速离心机主要由一个椭圆形的转子、一套真空系统和一套光学系统所组成。该转子通过一个柔性的轴连接成一个高速的驱动装置，此轴可使转子在旋转时形成自己的轴。转子在一个冷冻的真空腔中旋转，其容纳两个小室：分析室和配衡室。分析室的容量一般为，呈扇形排列在转子中，其工作原理及一个普通水平转子相同。分析室有上下两个平面的石英窗，离心机中装有的光学系统可保证在整个离心期间都能观察小室中正在沉降的物质，可以通过对紫外光的吸收（如对蛋白质和）或折射率的不同对沉降物进行监测。在分析室中物质沉降时重粒子和轻粒子之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照相底板上产出一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，故“峰”也在移动，从峰移动的速度可以得到物质沉降速度的指标。

图 分析型超速离心系统示意图
②分析性超速离心法的应用范围：测定生物大分子的相对分子重量。测定相对分子重量中应用最广的是沉降速度法，用照相记录，即可求出粒子的沉降系数。生物大分子的纯度估计。分析型超速离心机已广泛地应用于研究制剂、病毒和蛋白质的纯度。分析生物大分子中的构象变化。可以通过检查样品在沉降速度上的差异来证实。
离心机的分类及结构
（）离心机的分类 国际上对离心机的分类方法有三种，按用途分、按转速分、按结构分。按用途可分为制备型、分析型和制备分析两用型；按转速分类可分为低速、高速、超速等离心机；按结构可分为台式、多管微量式、细胞涂片式、血液洗涤式、高速冷冻式、大容量低速冷冻式、台式低速自动平衡离心机等。
（）低速离心机 它主要用作血浆、血清的分离及脑脊液、胸腹水、尿液等有形成份的分离；高速离心机：它主要用于临床实验室分子生物学中的、的分离和基础实验室对各种生物细胞、无机物溶液、悬浮液及胶体溶液的分离、浓缩、提纯样品等；超速离心机：超速离心机按用途分为制备型、分析型及分析制备两用型三种。制备型超速离心机主要用于生物大分子、细胞器和病毒等的分离纯化，能使亚细胞器分级分离，并可用于测定蛋白质及核酸的分子量；分析型超速离心机装有光学系统，可拍照、测量、数字输出、打印自动显示系统等，可以通过光学系统对测试样品的沉降过程及纯度进行观察。
（）专用离心机
①免疫血液离心机:用于临床输血、血型鉴定、交叉配血、淋巴细胞分离、血小板分离以及抗人球蛋白试验等。
②微量毛细管离心机:用于血溶比试验，微量血细胞比积以及同位素微量标记物的测定。
③尿沉渣分离离心机:用于尿液中有形成份的分离及尿液工作站相配套。
④细胞涂片离心机:用于脑脊液、胸腹水的脱落细胞的分离及涂片。
（）低速离心机、高速（冷冻）离心机及超速（冷冻）离心机的结构:
①低速离心机的结构由电动机、离心转盘（转头）、调速器、定时器、离心套管及底座等主要部件构成.
②高速(冷冻)离心机的结构由转动装置、速度控制系统、温度控制系统、真空系统、离心室、离心转头及安全保护装置等。
③ 超速(冷冻)离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。
（）离心转头的分类应用及功能：
离心机转头一般可分为五大类有:
①固定角转头
②甩平式转头
③连续流动转头
④区带转头
⑤垂直转头。
（）离心机的主要技术参数及性能指标：主要参数包括：最大转速；最大离心力；最大容量；电源功率；温度控制范围；工作电压；调速范围。离心机转头的常用标记及转头参数。离心机转头的常用标记是由三部分组成，第一部分为英文字母符号；第二部分为数字；第三部分为标识转头由不同的金属组成。转头参数有， 、 、 、 、 、Ｋ等。
离心机的应用和维护
（）离心方法的选择: 选择合适的离心转速和离心时间，就能达到较好的分离效果。①若样品中存在两种以上质量和密度不同的样品颗粒，可采用差速离心法。②对于有密度梯度差异的样品介质，可采用密度梯度离心法。③若不同样品颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内，离心时密度不同的物质颗粒因浮力差异或向下沉降，或向上漂浮，一直移到它们各自密度恰好对应的位置（等密度点），形成区带。可采用等密度梯度离心。
（）离心时间以及温度和值的确定
    离心时间：依据离心方法的不同有所差别。①差速离心是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。②等密度梯度离心是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。③密度梯