蛋白质组学与分析技术课复习思1考.docx

蛋白质组学及分析技术课复习思考

一、名词解释
1、蛋白质组学：
蛋白质组学是研究及基因对应的蛋白质组的学科，蛋白质组〔proteome〕一词，源于蛋白质〔protein〕及 基因组〔genome〕两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质〞,即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
2、二维〔双向〕电泳原理 ：
根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点上下进展别离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进展别离。二维电泳别离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质。
3、三步纯化策略 ：
第一步:粗提。纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶)
最适用层析技术: 离子交换/疏水层析
第二步：中度纯化。去除大局部杂质
最适用层析技术: 离子交换/疏水层析
第三步：精细纯化。到达最终纯度(去除聚合物,构造变异物)
最适用层析技术:凝焦过滤/离子交换/疏水层析/反相层析
4、高效纯化策略
在三步纯化蛋白质过程中，同时考虑到纯化的速度、载量、回收率及分辨率的纯化策略。
5、离子交换色谱：
离子交换色谱中的固定相是一些带电荷的基团，这些带电基团通过静电相互作用及带相反电荷的离子结合。如果流动相中存在其他带相反电荷的离子，按照质量作用定律，这些离子将及结合在固定相上的反离子进展交换。固定相基团带正电荷的时候，其可交换离子为阴离子，这种离子交换剂为阴离子交换剂；固定相的带电基团带负电荷，可用来及流动相交换的离子就是阳离子，这种离子交换剂叫做阳离子交换剂。阴离子交换柱的功能团主要是－NH2，及－NH3 ：阳离子交换剂的功能团主要是－SO3H及－COOH。其中-NH3 离子交换柱及-SO3H离子交换剂属于强离子交换剂，它们在很广泛的pH范围内都有离子交换能力；-NH2及-COOH 离子交换柱属于弱离子交换剂，只有在一定的pH值范围内，才能有离子交换能力。离子交换色谱主要用于可电离化合物的别离，例如，氨基酸自动分析仪中的色谱柱，多肽的别离、蛋白质的别离，核苷酸、核苷和各种碱基的别离等。
6、吸附色谱
吸附色谱系色谱法之一种，利用固定相吸附中对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的别离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子及物质分子竞争固定相吸附中心的过程。洗脱次序∶一般为正相，即：极性低的先被洗脱。
7、PCR扩增
PCR技术〔polymerase chain reaction〕技术能把单个目的基因大量扩增，这个方法必须在基因序列或该基因所翻译的氨基酸序列。进而推断出因序列的情况下使用。PCR的每次扩增循环包括三步:1〕变性,在高温下把双链靶DNA拆开； 2〕 在较低的温度下使引物及靶DNA互补； 3〕 在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长。典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增。
8、基因组文库
基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆这总和。
广义的基因文库指来于单个基因组的全部DNA克隆，理想情况下应含有这一基因组的全部DNA序列〔遗传信息〕，这种基因文库常通过鸟枪法获得。
狭义的基因文库有基因组文库和cDNA文库之分。基因文库可用于研究基因的构造、功能和筛选基因工程的目的基因。
9、cDNA文库:
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，及适当的载体〔常用噬菌体或质粒载体〕连接后转化受体菌，那么每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。真核生物基因组DNA庞大，复杂度是mRNA和蛋白质的100倍左右，而且含有大量的重复序列，和不被表达的间隔子。这是从染色体DNA出发材料直接克隆目的基因的主要困难。而从mRNA出发的cDNA克隆比基因组克隆要简单得多。

10、基因芯片
基因芯片又叫DNA芯片〔DNA chip)，DNA微阵列〔DNA microarray), DNA集微芯片〔DNA microchip〕,寡核苷酸阵列〔oligonucleotide array〕。
是一种将核酸分子杂交原理及微电子技术相结合而形成的高新生物技术。
将靶标样品核酸或探针中的任一方按阵列形式固定在固相载体〔硅片、尼龙膜、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、玻璃片等〕上，另一方用荧光分子标记后，加样至微阵列上杂交，然后用荧光扫描或摄像技术记录，通过计算机软件分析处理，获得样品中大量的基因序列和表达信息。
11、基因敲除：
基因敲除〔gene knock out〕，又称基因打靶〔gene targeting〕,是指用外源的DNA及受体细胞基因组中顺序一样或非常相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。对一个构造但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因敲除，或用其他顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动〔植〕物，推测相应基因的功能。
12、同源建模：
是一种蛋白质构造预测方法，具体指是利用同同源蛋白质构造为模板来预测未知蛋白质的构造。同源性大于50％时，结果比拟可靠；30～50％之间， 其结果需要参考其它蛋白的信息。同源性小于30％时，人们一般采用折叠识别方法。同源性更小时，从无到有法更有效。
一级序列――搜索数据库中已有构造的同源序列〔或者构造域〕――挑选模板蛋白――序列和构造配比――模建保守区域――模建环区――模建侧链
二、简答题
1．蛋白质组学主要包刮那些分析技术及各自特点
内容多：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质开掘、蛋白质差异显示、同工体比拟、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化及发育、肿瘤发生及开展、环境反响及调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。
分析技术面广：氨基酸组分、序列测定；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳； 蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质构造及功能；园二色谱；X光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术。

一、实验样品的制备原则
1)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态〔包括多数疏水性蛋白〕，且制备方法应具有可重现性。
2)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
3)防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰〔如酶性或化学性降解等〕。
4)完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。
5)尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。
二、蛋白质的别离纯化方法
〔一〕根据分子大小不同的纯化方法：透析和超过滤
〔二〕利用溶解度差异的纯化方法
1.等电点沉淀
调整溶液pH，不同蛋白在各自 pI处依次沉淀。
2.盐溶和盐析：

〔三〕蛋白质的沉淀
1．可逆沉淀：
温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷，Pr构造和性质没有变化，适当条件下可重新溶解。——非变性沉淀。pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
2．不可逆沉淀：
强烈沉淀条件，破坏Pr胶体溶液稳定性，也破坏Pr构造和性质，沉淀不能再重新溶解。
——变性沉淀。如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等。
4.简述高效液相色谱、气相色谱、质谱、液质联仪的工作原理及用途
1〕高效液相色谱：是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被别离后，进入检测器进展检测，从而实现对试样的分析。主要应用于氨基酸分析、肽和蛋白质的别离分析及糖类的分析，还包括蛋白质的别离纯化、氨基酸组成分析〔氨基酸标本，N端测序〕、蛋白质酶切肽段的别离、注入质谱后进展蛋白质组学的分析、样品纯度的粗鉴定。
2〕气相色谱：
3〕质谱：
质谱现象的就是不同电荷Z和质量m的各种离子碎片的质量〔严格地说应是质量对电荷的比值，质荷比m/z〕，这些质荷比并不直接给出有关离子构造的信息，但是质核比不同的离子碎片的种类及其相对含量及试样分子的组成和构造有关。
通过对质谱的分析〔试样分子可能产生的各种离子碎片分析〕和根据的大量化合物质谱图的信息，来了解试样分子的构造、组成及其分解历程。
在生物蛋白质中，目前质谱分析能解决的主要问题是测定蛋白质的一级构造，包括分子量、肽链中氨基酸排列顺序以及多肽键或二硫键的数目和位置。
质谱分析是解决核酸一级构造测定的最有利手段之一，包括分子量测定、核酸的序列分析；
同时利用质谱测定寡糖和多糖的构造。
4〕液质联用〔HLPC-MS〕：以液相色谱作为别离系统，质谱为检测系统。蛋白质样品在质谱局部和流动相别离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。可以对每一个肽段进展序列分析，综合所有MS数据来鉴定蛋白质，大大提高了鉴定的准确度。

它的别离效率高，选择性好，适于各种多元组分复杂混合物的别离；
它的应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成物质，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。可以说几乎包括了所有类型物质；
它可以根据别离对象，按不同别离机理，广泛选择色谱柱、淋洗体系和操作参数；
它即是精细的别离纯化方法，也是快速、灵敏、准确、简便的分析检测手段；
它可以处理从痕量、微量到常量以至较大规模制备的样品量，可以实现在线检测和自动化操作。

1.蛋白质的N端测序
固相Edman降解是将蛋白质和多肽通过共价偶联在惰性载体上,因而蛋白质及多肽样品及多余的反响试剂以及切割后产生的氨基酸衍生物的别离就非常容易。具体步骤：
1〕采用常规的SDS-PAGE方法，凝胶浓度通过前期的实验确定，电泳方法按照Laemmli方法进展.
2〕电印迹实验：将蛋白质印迹转移到PVDF(聚偏二氟乙烯)膜上，然后将此PVDF膜片放入测序仪的反响室进展Edman降解。最近， PE／ABI公司推出的配备毛细管HPLC的Procise—CLC型序列仪， PTH氨基酸检测的灵敏度可达0.1p mol。
3〕根据各个氨基酸的色谱图及标准氨基酸图谱的对照，可以按顺序测定氨基酸的种类，从而得到蛋白质序列。
4〕测序单位根据所提供样品的数量测定了N端的15个氨基酸的序列，足以用来进展PCR引物的设计。
2.运用质谱进展肽段序列测定
测序时，先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进展酶解，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)和SV8酶(staphylococcus aureus V8)等。各个酶解片断用HPLC等别离得到的纯肽或者简单的混合肽，可以用MS-MS测定其各组分的顺序，然后通过不同的蛋白水解酶酶解片段顺序，找到重叠局部。进而可得到整个蛋白质的顺序。
蛋白质经过电泳后，别离得到的蛋白质点被切割下来，进展胶内的酶解，或者转印到PVDF膜上，进展膜上酶解。而目前以胶内酶解应用更多。酶解后的产物可以用LC-MS分析肽谱，采用MS-MS测定肽段的序列，然后及数据库中蛋白质的肽质谱比拟，就可以确定蛋白质是否，或是何种蛋白。
cDNA文库的构建各有哪些根本步骤
基因组文库的构建
〔1〕细胞染色体大分子DNA的提取和大片段的制备；
〔2〕载体DNA的制备；
〔3〕载体及外源大片段连接；
〔4〕体外包装及基因组DNA文库的扩增；
〔5〕重组DNA的筛选和鉴定。
构建cDNA文库通常包括
1〕 mRNA的提取及其完整性确实定；
2〕cDNA的合成和克隆；
〔1〕cDNA第一链的合成
〔2〕双链cDNA的合成
〔3〕cDNA基因及载体的重组
〔4〕转化
〔5〕目的cDNA克隆的鉴定
〔6〕特定cDNA的克隆
3〕目的cDNA的鉴定等步骤。

制作芯片 合成探针 杂交 结果扫描 分析数据
1〕DNA微阵列的制备
靶DNA的制备和纯化：以cDNA文库克隆作为靶DNA.
点样：选用Corning GAPS玻片〔用g-amino saline包被〕,自动点样仪点样
点样后处理：玻片置于下紫外交联仪中交联〔 70 mj 〕，80℃下烘烤2~4h
2〕探针的制备和纯化：提取两个不同基因品系中的mRNA，用氨基酸修饰的dUTP合成cDNA,分别用Cy3和Cy5标记
3〕预杂交：制备预杂交溶液
4〕杂交：制备杂交缓冲液；探针变性；探针及芯片杂交
5〕杂交后处理：洗去未结合的探针
6〕扫描、数据读取和分析：将玻片置于激光共聚焦扫描显微镜〔扫描仪〕中进展扫描，应用数据读取和分析软件进展分析。

1检验－对功能蛋白间的相互作用
优点快速和高灵敏度，且反映了蛋白在体内的相互作用；还能检测出瞬间发生的信号反响，而用体外检测法检测蛋白要经过一系列洗涤过程，常致使相互作用不再发生。融合蛋白由于BD和DNA序列的相互作用而变得更加稳定。并且杂合蛋白一般都是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，在转录过程中产生了一些复合酶使信号得以放大。
2研究一对蛋白间发生相互作用所必需的构造域
可应用于确定两有生理作用的蛋白间的作用位点或构造域。利用此系统已分析和测定了多种重要的构造域，当证实了两个蛋白有相互作用后，可以对其进展缺失实验而找到相互作用发生所必须的氨基酸残基。通过该方法还能研究蛋白质的构造及功能。通常需要对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。
3发现新的作用蛋白质
用功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径，寻找及靶蛋白相互作用的新蛋白，是双杂交系统最广泛和最有价值的应用。
4 寻找具有药物治疗作用的小分子多肽
通过双杂交系统筛选和目标蛋白相互作用的多肽，如靶蛋白是药物设计的目标，那么有可能得到一些具有药物治疗作用的小分子多肽药物。
5分析新基因的生物学功能
即以功能未知的新基因蛋白克隆在BD载体上，而把将要筛选的cDNA文库克隆在AD载体上，利用双杂交技术可以找到一个新的结合蛋白，这个结合蛋白可能是基因也可能是未知基因所编码，然后根据调到的基因的功能推测该新基因的功能。
6寻找调控蛋白相互作用的蛋白，在恢复转录活性的双杂交系统中参加某一分子化合物后再检测报告基因的表达强度，可用来寻找抑制蛋白质之间相互作用的小分子化合物。
7蛋白质相互作用图谱的构建
随着基因组研究方案的开展，及mRNA在不同组织器官的不同发育阶段表达图谱的构建，蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。酵母蛋白质相互作用的横向研究是近年来双杂交系统最引人注目的应用，用以提醒多种细胞活动过程中各控制因子间的联系。
10.请试图阐述蛋白质结晶中的悬滴法〔hanging drop〕