细胞信号转导研究方法.doc

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细胞信号转导途径研究方法

一、 蛋白质表达水平和细胞内定位研究
1、 信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis.
蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后,分离为不同条带，其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)，将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting，以利于随后的检测能够的进行，随后,将NC膜与抗血清一起孵育，使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带)，再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。
基本流程：

检测示意图：

2、免疫荧光技术 Immunofluorescence （IF）
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。

二、 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术
1、 免疫共沉淀 （Co- Immunoprecipitation, Co-IP）
Co-IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”能特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象而开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在agarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原抗体达到沉淀抗原的目的。

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。进一步进行Western Blot和质谱分析。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。缺点：可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用。
2、 GST pull-down assay
GST pull-down assay是将谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白（标记蛋白或者饵蛋白，GST, His6, Flag, biotin …）作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白(test protein或者prey被扑获蛋白)结合，然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。一般在发现抗体干扰蛋白质－蛋白质之间的相互作用时，可以启用GST沉降技术。该方法只是用于确定体外的相互作用。

示意图：

3、 酵母双杂交系统
酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录因子 GAL4在结构上是组件式的（modular），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功能上相互独立的结构域（domain）构成，其中有DNA结合功能域（DNA binding domain,DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。
将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体(“猎物”或靶蛋白prey or target protein)，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。
过程示意图：

4、 荧光共振能量转移
荧光共振能量转移(FRET)是对生物大分子之间相互作用定性、定量检测的一种有效方法，是在活体细胞中实时地对生物大分子之间的相互作用进行动态监测.
两个携带不同荧光基团（如GFP、YFP、CFP等）的大分子在相互间距离足够近时会发生激发态能量非放射性地由一个荧光基团（供体）向另一个荧光基团（受体）转移的现象。如果发生FRET，则供体信号将淬灭而受体信号将激活或增强. FRET 检测系统可以快速高效地捕获来自标定分子间相互作用的短暂微弱的荧光信号，而以分子尺度分辨出供体-受体的平均距离，并能显示出受体-供体的相互作用。
过程示意图：

以光线激发后，供体荧光基因(ECFP–X)会将激发能量转移至距离10–100 Å 以内的受体荧光基因(EGFP–Y)，进而使之发出荧光。研究人员即可通过检测受体荧光基因激发的荧光确认两蛋白质间的相互作用。ECFP：强化型蓝荧光蛋白质(enhanced cyan fluorescent protein)；EGFP：强化型绿荧光蛋白质(enhanced green fluorescent protein)。

三、磷酸化蛋白质研究方法
磷酸化蛋白质研究方法主要有：
1、激酶活性的测定
信号转导过程中往往涉及多种激酶的活化，因而对这些激酶活性的测定在信号转导研究中具有重要意义。常见激酶活性的测定有PTK、PKC、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。
其它还有：
2、Western blot with phospho-specific antibodies.
3、Changes in mobility in SDS-PAGE
4、Phosphopeptide and phospho amino acid analysis by mass spectrophotometric analysis.

四、基因表达或转录活性检测

1、 信号蛋白转录水平表达（mRNA）的检测:
（1） RT- PCR / Realtime RT- PCR
（2） Northern blot analysis.
（3） RNase protection assay (RPA).
（4） “gene chip” to measure changes in gene expression at larger scales
2、 基因启动子/增强子转录活性的检测:
（1）Transient or stable reporter assay—luciferase (Luc) or choramphenicolacetyl- transferase (CAT，氯霉素乙酰转移酶基因)
（2）Nuclear run-on assay

五、蛋白质与DNA相互作用的研究技术

1、 凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）
是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。

2、染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。CHIP是用于研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集与目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
过程示意图：

六、信号转导中第二信使含量的测定

第二信使含量的高低同信号传递密切相关。
1、[Ca2+]的测定：原子光谱法、离子微电极测定法、放射示踪法及标记示踪法等。目前常用标记示踪法，即用荧光探针标记靶细胞。常用的荧光探针有quin-2/Am、Fura-2/Am及Indo-1等，后二者较为敏感。
2、IP3的测定：采用3H-TdR标记的肌醇标记靶细胞后，用不同的刺激剂刺激细胞，分离磷脂酰肌醇混合物，通过阴离子交换层析柱分离洗脱，收集IP3洗脱峰后进行液闪测定。此外，还可以使用Amersham公司生产的D-myo-IP3[3H]分析系统直接测定粗提物中的IP3含量，此方法简易、敏感。
3、DAG的测定：首先提取含DAG的样品，用DAG激酶催化底物DAG，使之发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，最后将反应产物进行分离后测定放射性含量，根据标准品计算出样品中DAG的含量。
4、cAMP的测定：（1）cAMP[3H]分析系统，其优点是放射性半衰期长，可用于大量样品的分析；（2）cAMP[125I]分析系统，用于小量样品的分析；（3）cAMP ELISA测定方法，此方法简便、敏感。
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