细胞实验技术.doc

（一）干扰引物（shRNA）设计：
1、 NCBI上下载基因序列
2、 在sigema网站输入基因号设计一对21个碱基的干扰引物（上下游）
3、 从起始密码（ATG）下游25bp开始；
4、 GC含量介于40%~60%
5、 干扰引物至少一个在SDS区，一个在3’UTR区
6、 选择脱靶率低的

（二）、干扰载体构建
1、引物退火（引物加水看标签X 50,弹匀，瞬离）
退火体系：
上游： 5ul
下游： 5ul
10X M buffer 5ul
H2O 35ul
水浴锅100℃ 2min，锅里隔夜

（三） 、酶切plko.1载体
1、AgeI 酶切，反应体系：
plko.1载体 4ug
AgeI 2ul
10X AgeI buffer 5ul
H2O 39ul
37℃水浴2~3h
2、切胶回收AgeI 酶切产物，30ul 水洗脱
3、EcoRI酶切，反应体系：
AgeI 酶切产物 30ul
EcoRI 2ul
10X H buffer 5ul
H2O 13ul
37℃水浴2~3h
切胶回收，30ul 水洗脱，测浓度

（四） 、连接
连接体系： T4连接：
退火引物 2ul 退火引物 5ul
酶切载体 1ul 酶切载体 1ul
Solution I 5ul T4连接酶 1ul
H2O 2ul T4连接酶Buffer 1ul
H2O 2ul
室温下连接4h。
（五） 、转化
-80℃取感受态细胞于冰上融化，在1.5ml离心管加33ul感受态，将连接产物加入，冰上放置30min，42℃水浴60~90s，冰上放置2min，加入无氨苄培养基，37℃摇床1h，涂布在氨苄平板上，37℃，16h。

（六） 、挑菌
用枪头挑取5个菌落（可送测序）扩大培养，加有氨苄的培养基，37℃过夜培养。

（七） 、提质粒
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。
1、取5ml菌液于离心管，12000 rpm 1min ，弃上清
2、向沉淀加500 ul P1 ，震荡重悬
3、加入 500 ul P2 ，温和翻转 6~8 次，充分裂解 （不超过5 min，一般3min）
4、加入 700 ul P3 ，温和翻转 6~8 次， 出现白色絮状沉淀，12000 rpm 10 min
5、将上清加入CS柱（已放入收集管），12000 rpm 2min，将收集管中液体加入吸附柱CP4中，12000 rpm ，
1min ，弃废液
6、CP4柱中加入 500 ul PD ,12000rpm ，1 min ，弃液
7、CP4柱中加入 600 ul Pw,室温放置3 min ,12000rpm ，1 min ，弃液
8、空离 12000rpm ，2 min，室温放置几分钟（把乙醇蒸发）
9、CP4柱置于1.5ml 离心管，向柱中心加35 ul ddH2O ，室温放置 2 min ，12000rpm ，1 min。
（八） 、测质粒浓度
打开软件，ddH2O 清洗仪器3~5次，点击 black ，F1，结果不大于0.2
每个样品吸取1ul，于仪器上，F1，结果浓度大于 500， OD值1.88~1.90
质粒置于-20 ℃，保存

（九） 、细胞复苏
1、37℃预热PBS， 取 8ml PBS 于10 ml 离心管中
2、液氮中取出冻存的细胞，37℃水浴融化
3、吸取冻存细胞于PBS中，轻混匀，室温 800 rpm 3min ，去上清，加入1ml 培养基重悬，
4、细胞重悬液加到 含 8ml 培养基的培养皿中，37℃，5% CO2 ,培养
（十） 、细胞分盘
1、吸去培养液，加入 PBS 清洗
2、吸去 PBS ，加入 1ml 胰酶，37℃ 培养箱消化 1min
3、用巴氏吸管加入 2ml 培养液终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，
室温，5 min
4、加入1ml培养液重悬，按 1；3 分盘
（十一） 、转染
1、 PLP1 625 ng/孔
PLP2 625 ng/孔
2ml 离心管 PLP/VSVG 625 ng/孔 混匀
目的质粒 625 ng/孔
Opti 培养基 500ul/孔

2、 脂质体 6ul/孔
2ml 离心管 请轻混匀，室温下孵育，5 min
Opti 培养基 500ul/孔
将质粒和脂质体混合，轻轻混匀，室温孵育20 min
3、吸去细胞培养皿中的培养液，加入 3 ml PBS 清洗，加 1ml 胰酶，37℃消化，加培养液终止消化；收集于5ml离心管，750 rpm，室温，5 min；弃上清，加入Opti 培养液重悬
4、在六孔板中加入850ul Opti 培养液，加入包装的脂质体，混匀后加入细胞重悬液，十字摇匀，37℃，5% CO2 ,
培养，6~8h 后去除培养基，加入3ml 新转染培养基，继续培养两天
（十二） 、收病毒
培养第四天的转染细胞，用注射器吸取培养基，用0,45um 滤膜过滤到1.5ml 离心管，每管1 ml。最后向培养皿中再加3ml转染培养基，，继需培养，第二次收病毒。
（十三） 、病毒转染细胞
1、取培养的目的细胞，吸去培养液，加入1ml 含 4 ug/ml polybrene 的慢病毒培养基，再加入1 ml 病毒液，混匀，37℃，5% CO2，培养48h
2、将感染的目的细胞加到生长培养基培养，
3、用适当浓度的抗生素筛选靶细胞
4、收细胞
（十四） 、收细胞（用于提蛋白，提RNA）
1、吸去培养液，加入 PBS 清洗
2、吸去 PBS ，加入 1ml 胰酶，37℃ 培养箱消化 1min
3、用巴氏吸管加入 2ml 培养液 终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，
4℃，5 min
4、弃上清，加1ml PBS，重悬，转移到1.5ml 离心管1000 rpm ，4℃，5 min
5、弃上清 ，立刻放入液氮中保存。
（十五） 、冻存细胞
1、准备冻存液
2、吸去培养液，加入 PBS 清洗
3、吸去 PBS ，加入 1ml 胰酶，37℃ 培养箱消化 1min
4、用巴氏吸管加入 2ml 培养液 终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，1000 rpm ，
4℃，5 min
5、弃上清，加入1 ml 冻存液重悬，转移到冻存管。
（十六） 、提蛋白
1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入细胞裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解 30
min
2、13000 rpm ， 4℃ ， 10min ，弃沉淀
3、配制蛋白标准液，稀释至 0.5 mg / ml ，配制BCA 试剂（A液：B液= 50:1）
4、标准液体积按0；1；2；4；8；12；16；20 加入 96 孔板，补 PBS 至 20ul
5、 96孔板 加 1 ul 蛋白样品，PBS 补足 20 ul ，每个重复 3次
6、每孔加入 200ul BCA ， 37℃， 30 min
7、酶标仪 560 nm 测吸光值
8、将蛋白样品稀释，加入 loding buffer，4℃，瞬时离心， 100℃ 煮 10 min，13000 rpm，30 s
（十七） 、WB
1. 清洗玻璃板
2. 灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）
（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时待胶面升到绿带下线高度时即可。然后胶上加异丙醇，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）
（3）待胶凝后，倒去胶上层异丙醇并用吸水纸吸干。
（4）配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
（5）将胶板安装到电泳架上（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。），倒入电泳 buffer，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。点样，marker，10 ul （上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。）
（5）将其放入电泳槽中。
3. 电泳
电泳时间一般100 V，90 min 。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
4、转膜
1. 剪取一张 5.5 X 8.5 的 PVDF 膜。将切好膜置于甲醇中浸泡，激活，转移到 去离子水中清洗。最后在
转膜 buffer 中清洗。
2. 在加有转膜 buffer的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块滤纸垫、一支滚棒、带胶的玻璃板。
3. 在转膜盒上面铺一张滤纸垫，加入转膜 buffer，用滚棒来回擀几遍以擀走里面的气泡，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 将膜铺于滤纸上；
5、将玻璃板撬开，除去大玻璃板后，将浓缩胶切去，取下分离胶盖于膜上上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。最后盖上另一个滤纸垫，擀几下盖上盖子。
6. 将转膜槽放入转膜仪。25 V，30min。
5、封闭
1、 转膜后，移至含有封闭液的平皿中，室温下，摇床上，封闭2 h。
2、 封闭后，1 x TBST 清洗 3次，加入一抗，4℃，过夜；
3、回收一抗，1 x TBST 清洗 3次，每次10 min；
4、加入 二抗，室温1 h
5、 弃二抗，1 x TBST 清洗 3次，每次10 min。
6、显色曝光
将膜放到曝光仪上，加入显色液，曝光
（十八） 、提 RNA
1、将收集到的细胞从-140℃液氮中取出置于冰上，加入500 裂解液（已加入PMSF）,吹打5~6次，冰上裂解
30 min
2、13000 rpm ， 4℃ ， 5 min ，弃沉淀
3、加入适量（350ul ~450ul）的RTL lysis Buffer 至离心管，重悬
4、加入等体积 RNA Binding Buffer 至离心管，混匀
5、把 HiPure RNA Mini Column 装在2ml 收集管，转移小于 700ul 混合液，12000rpm，30s
6、弃滤液，继续转移
7、加500 ul Buffer RW1 ,12000rpm，30 s
8、弃滤液，加入650 ul Buffer RW2，12000rpm，30 s
9、弃滤液，空离
10、柱子转移至1.5ml 离心管，加入 30~100 ul RNase Free Water 至膜中央，静止 1 min，12000rpm，1 min
（十九） 、PCR 合成cDNA
解链反应体系：
总 RNA 1~2 ul
引物 1 ul
Oligo（dT） 1 ul
无RNA酶水 补足 8 ul
70 ℃ 水浴 5 min；冰上 5 min
逆转录体系 ：
5 X M-MLV buffer 5 ul
dNTP 2ul
RNase 抑制剂 1 ul
M-MLV 1 ul
无RNA酶水 8 ul
总体积 25 ul
42℃，90 min ； 70℃ ， 10 min PCR， -20 ℃保存
（二十）、RT-PCR
利用持家基因 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH 作为内参基因，采用荧光定量PCR 的方法检查基因的表达水品。
1、根据基因和 GAPDH 的基因序列设计引物，
2、反应体系：
Mix 10 ul
上游引物 0.5 ul
下游引物 0.5 ul
水 7 ul
模板 2 ul
每个样品设计3个重复，反应条件： 95℃ 变性；60℃ 退火，设置 45个循环。 Tm设为 95℃
（二十一）、soft agar
底层胶制备：
1、 2XDMEM 培养基 预热；1.2% 的Agar 溶液预热；两者混合
2、 加到6孔板中。每孔 1ml ，2个重复，3个对照；加入时避免产生气泡，静置20 min，凝固
上层胶的制备
1、 吸去培养液，加入 PBS 清洗
2、吸去 PBS ，加入 1ml 胰酶，37℃ 培养箱消化 1min
3、用巴氏吸管加入 2ml 培养液 终止消化，用枪头冲洗培养皿，将液体转到5 ml 离心管中，750 rpm ，
室温，5 min
4、加入1ml培养液重悬
5、细胞计数，并稀释至适当浓度
6、取 1.5 ml 2 X DMEM 与 1.5 ml 的0.6%Agar 溶液混合，再与合适量的的细胞悬液混合（每孔加入2000个细胞），每孔加入1.5 ml 底层胶。避免产生气泡，静置，凝固
7、置于 37℃，5% CO2，培养15~20天。
（二十二）、BrdU
1、取对数生长期细胞，在24孔板上进行细胞爬片（每孔2万细胞），置于 37℃，5% CO2 培养过夜
2、每孔添加500ul BrdU 溶液（每毫升培养基10ulBrdu），37℃，5% CO2 培养，30 min
3、弃培养液，加入200 ul/孔 4% 多聚甲醛，室温， 30 min
4、弃 多聚甲醛 ，PBS 摇床清洗 3次，每孔 500 ul ，每次 5min
5、加入 500 ul 0.1% Triton-100 ，室温，10 min
6、PBS 摇床清洗 3次，每孔 500 ul ，每次 5min
7、加入 500 ul/ 孔 盐酸溶液，37℃ ，10 min
8、PBS 摇床清洗 3次，每孔 500 ul ，每次 5min
9、加入 500 ul/孔 10% 山羊血清，37 ℃，封闭 30min
10、加入BrdU 一抗 ，500ul/孔，4℃，过夜
11、室温复温 45 min
12、PBS 摇床清洗 3次，每孔 500 ul ，每次 5min
13、加入 荧光二抗 ，500ul/孔，室温，120 min
14、加入DAPI ， 50 ul/孔 ，室温，避光，30 min
15、PBS 摇床清洗 3次，每孔 500 ul ，每次 5min
16、取出玻片，滴加抗荧光淬灭剂，封片
（二十三）、MTT(一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成蓝色的formazan结晶，生成量仅与和细胞数目成正比，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原，无法形成结晶，该结晶溶解于DMSO。490nm处测OD值
1、 取对数期细胞，计数，稀释
2、 取96孔板，每孔加30000个细胞，重复4个复孔，置于37℃，5% CO2 培养
3、 选择对应时间点的细胞，每孔加入20ul的MTT溶液，置于37℃，5% CO2 培养4
4、 取出细胞板，吸去液体，每孔加入200ulDMSO溶液，置于摇床上，10min
5、 490nm测吸光值
（二十四）、GST pull-down（通过已经标记的 GST标签蛋白，从细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白，用以确定已知蛋白与钓出蛋白或已纯化的相关蛋白间的相互作用关系，GST 标签的 A 蛋白（GST-A）与另一标签的 B 蛋白）
GST-A蛋白的beads制备
1. 把 GST-A（pGEX 载体）质粒转化到感受态细胞 BL21（DE3）中。转化：冰上放置 30 min，42℃ 热激 45s，冰上放置 2 min。
2. 加入适量 LB 无 Kana 液体培养基摇菌 1 h，37 ℃，220 rpm/min。
3. 把菌液转移到摇菌管中，5 ml LB+Kana，37 ℃，220 rpm/min 小摇过夜。
4. 把 5 ml 小摇过夜的菌液转移到 150 ml LB+Kana 培养基中，继续 37 ℃，220 rpm/min 摇菌 4～5 h。
5. 加入 IPTG 使其终浓度为 0.5 mM，低温诱导 4～5 h（一般设置为 22 ℃）。
6. 5 000 rpm/min，离心 10 min 收菌体沉淀 -80 ℃ 保存。
7. 用 10 ml GST Extraction buffer 重悬菌体沉淀，涡旋震荡混匀（具体用多少重悬视菌体沉淀量而定）。
8. 超声处理样品。（注意：一定要在冰上进行，此步非常重要。超声探头使用前请用酒精擦洗并用 ddH2O 擦洗。探头放在液面中间，不碰壁，不触底。仪器设置为 5 s 工作，15 s 休息，防止产热过量）。
9. 15 000 rpm/min，4 ℃，离心 30 min。
10. 每个样品 100ul Glutathione Sepharose（GST beads，用量自定），冰 PBS 洗 2 遍，GST Extraction buffer 洗一遍，每次 500 g/min，离心 5 min，4 ℃。
11. 转移离心后的菌液上清到 Glutathione Sepharose 中，4℃ 转动孵育 1 h。
12. 500 g/min，5 min，4 ℃，去上清。用 GST WashⅠ洗 3 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。
13. 用 GST Extraction buffer 洗 5 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。
14. 用 GST Wash Ⅱ 洗 2 遍（至少用 5 倍 beads 体积的溶液去洗。每次 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min）。
15. 纯化好的带有 GST-A蛋白的 GST beads 保存在 GST Wash Ⅱ中，4 ℃ 保存（这是由 GST beads 特性决定的，请尽早使用）。
His-B 蛋白的纯化
16. 菌体沉淀制备过程类似于 GST-A，8 000 rpm/min，离心 2 min 收沉淀。具体纯化过程因为篇幅所限就不在此讲述了。
17. 当然，也可以用细胞裂解液来做 pull-down，那么这就不能算是纯粹的体外验证蛋白与蛋白相互作用的实验了，再此不多做讲述。
GST pull-down
1. 纯化好的 GAT-A beads 在使用前用冰 PBS 洗 3 遍，每遍 500 g/min，4 ℃ 离心 5 min。
2. 加入适量的 His-B 纯化蛋白（作者君认为 10ug 的量做 pull-down 已经足够了），binding buffer 是 PBS。
3. 4 ℃ 转动孵育 1 h。
4. 洗去非特异性结合：作者君一般是用 GST Wash Ⅱ buffer 洗 5～10 遍，具体次数看两者的结合强弱，需要自己摸索。（当然有 protocol 介绍是用 PBS 去洗，每次离心之前在 4 ℃ 转动孵育 5～10 min，这样清洗效果相对较弱，具体怎么洗看自己喽）。
5. 清洗结束后就可以加 loading 去煮蛋白跑 WB 了。
不过如果你需要跑出来更漂亮的 WB 条带，可以把 pull-down 后的样品用 GST 洗脱液（购自生工，觉得买一瓶后用一辈子也用不完）把蛋白洗脱下来：在 pull-down 样品中加入 100 ul GST 洗脱液（用量自定），4 ℃ 转动孵育 30 min，500 g/min，4 ℃ 离心 5 min，上清就是您想要的 pull-down 样品。
（二十五）石蜡切片免疫组化实验
免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原 (多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常用。
实验方法原理 根据聚合酶技术把辣根过氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子结合在多聚酶上形成多聚物分子,其与待检的抗原特异性的结合后，加入底物显色。
实验步骤
一、 组织块包埋
1、固定: 10% 甲醛 24h 4℃
2、PBS清洗 10min/次 6次或更多
3、自动脱水机脱水浸蜡
4、包埋（包埋机提前30min预开启）
5、修整、切片（4~7um）
6、贴片 水温45℃~46℃
7、脱蜡：切片置于67℃烘箱中，烘片2小时。
8、洗片：①二甲苯 8~10 min
②二甲苯 8~10 min
③1/2二甲苯 8~10 min
④无水乙醇 5min
⑤无水乙醇 5min
⑥95%乙醇 5min
⑦93%乙醇 5min
⑧85%乙醇 5min
⑨75%乙醇 5min
9、 苏木素染色，自来水冲洗
10、1%HCl分化，自来水冲洗，氨水返蓝，1~2min
11、伊红染色
12、自来水冲洗
13、 ①75%乙醇 2min 二甲苯 8~10 min
②85%乙醇 2min 二甲苯 8~10 min
③95%乙醇 2min 1/2二甲苯 8~10 min
④95%乙醇 2min 无水乙醇 5min
⑤无水乙醇 5min
14、二甲苯透明，2X5min
15、中性树胶封固，晾干后观察。
（二十六）染色质免疫沉淀技术（CHIP）
真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达机制的基本途径。与传统的EMSA技术相比，染色质免疫沉淀技术（CHIP）能真实完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白，是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的最佳方法。
原理：是在活细胞状态下以甲醛固定蛋白质－DNA复合物，超声将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后加入目的蛋白抗体，通过抗体沉淀靶蛋白-DNA复合物，通过洗脱的方法得到富集的靶蛋白-DNA复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测（PCR分析），从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
步骤：1）甲醛处理细胞
2）收集细胞，超声破碎
3）加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合
4）加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀
5）对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合
6）洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物
7）解交联，纯化富集的DNA-片断
8）PCR或基因芯片分析。
实验案例 ：证明C/EBP与Tmub1启动子或增强子序列的结合
实验对照：设定的对照有
1、阳性对照（系统阳性对照，Anti-RNA Polymerase II）
2、INPUT对照（DNA片段在沉淀以前，收集下来的对照）
3、阴性对照（非免疫IgG血清吸附，Normal Mouse IgG）
EZ-ChIP™染色质免疫共沉淀实验流程（Upstste Catalog # 17-371)
1、Kit Description：试剂盒内含的RNA聚合酶II阳性对照抗体
2、试剂盒组分：
A. Provided Kit Components
Store at 4℃:
ChIP Blocked Protein G Agarose 1.5 ml
ChIP Dilution Buffer, One vial containing 24 ml
Low Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml
High Salt Immune Complex Wash Buffer 24 ml
LiCl Immune Complex Wash Buffer 24 ml
TE Buffer 24 ml
0.5 M EDTA 250 ul
5 M NaCl 500 ul
SDS Lysis Buffer 10 ml
1 M Tris-HCl, pH 6.5 500 ul
10X Glycine 11 ml
10X PBS 24 ml
Store at -20℃：
Protease Inhibitor Cocktail II（蛋白酶抑制剂） 2×110 ul
RNase A 600 ug of RNase A in60 ul sterile water.
Proteinase K 600 ug of ProteinaseK in 60 ul
1M NaHCO3 600 ul
Anti-RNA Polymerase II 25ug clone CTD4H8.
Normal rat IgG
Store at Room Temperature:
20% SDS 242 ul of 20% SDS.
Spin Filters One bag containing 22 Spin Filterswith Collection Tubes
Collection Tubes 22 Collection Tubes.
Bind Reagent A 25 ml of Bind Reagent A.
Wash Reagent B 12.5 ml of Wash Reagent B.
Elution Reagent C 1.5 ml of Elution Reagent C.
4、CHIP 操作流程
A. 细胞蛋白与染色质的交联及细胞裂解
预先准备：
1) 准备细胞，150 mm培养瓶（20ml培养液）密度为80-90%，细胞数量≥1 x 10-7个；
2) 准备42 ml 1X PBS (4.2 ml 10X PBS +37.8 ml water),放入150 mm培养皿以冰块预冷；
3) 取出SDS Lysis Buffer，放置至常温确保SDS溶解不析出；
4) Protease Inhibitor Cocktail II恢复至室温。
正式步骤：
1) 于培养瓶中加入终浓度为1%的甲醛，室温孵育10min；
2) 每个培养皿加入2 ml 10X Glycine（甘氨酸）混匀，室温放置5min，以中和甲醛反应；
3) 尽可能吸取培养基，不要损伤细胞（冰上操作）；
4) 以20 ml预冷的1X PBS洗涤培养皿，去掉PBS，重复洗涤1次；
5) 同时取干净试管加入2 ml预冷PBS，每管加5ul Protease Inhibitor Cocktail II；
6) 每培养皿加入2 ml PBS，刮取细胞至锥形管；
7) 4℃离心700rpm，时间5min以沉淀细胞，去掉上清；
8) 将5ul of Protease Inhibitor Cocktail II加入1 ml of SDS Lysis Buffer；
9) 以1 ml of SDS Lysis Buffer重悬细胞；
10) 分装细胞悬液取容积约300-400 ul 至微量离心管备用。
B. 超声处理裂解DNA
1) 管子置于碎冰上，超声处理以打碎DNA，超声发热会部分降解染色质，注意在冰上操作，普通贴壁细胞约1x 10-7个细胞/ml需要10次，每次4-5秒的超声处理；超声仪基本要求：50-100WW功率，1-2mm探头。
2) 4℃离心12000rpm，时间10min，移除沉淀，留下上清。
3) 上清转移至干净的微量离心管，每管约50-100ul；
C. 免疫共沉淀蛋白质/DNA
准备稀释液（Dilution Buffer,，含蛋白酶抑制剂）置于冰上备用，按照1块胶计算（9个样本）：900ul稀释液中加入4.5ul Protease Inhibitor Cocktail II。
注：IP应设置阳性对照(Anti-RNA Polymerase II)和阴性对照(Normal IgG)，阴性对照IgG应保持与目的抗体来源种属一致
D. 蛋白/DNA-复合物洗脱
预先准备：将1M的NaHCO3恢复至室温，使沉淀溶解。,
1) 准备Elution Buffer以备IP管和inpu