生物药物分析重点.doc

第一章 绪论
1. 生物药物分析：是生物工程制药专业设置的一门专业课，是应用微生物学、分子生物学、免疫学、生物化学、有机化学、数学、分析化学、生化工程等学科的理论及其技术成就，检测和研究各种生物药物质量的一门综合性学科。
2. 药典：是国家对药物质量标准及其检测方法所做的技术规定，是药物生产、监控、供应、使用及管理部门共同遵循的法令。
3. 我国的第一部药典1953年出版，从1963年版开始，中国药典分一、二部，药典内容一般包括凡例、正文、附录、索引四部分，生物药物收载在第三部分。
4. 美国药典—USP
英国药典—BP
日本药局方—JP
英国副药典或英国准药典—BPC
国际药典—Ph.Int
5. 基因工程药物的质量控制规则 （暂时未找到）
6. 生物药物质量的科学管理：（5个）
《良好药物实验研究规范》—GLP
《良好药品生产规范》 —GMP
《良好药品供应规范》 —GSP
《良好药品临床试验规范》—GCP
分析工作的质量管理 —AQC
第二章 生物药物的杂质检查
1. 药物的杂质：（定义）指药物中存在的无治疗作用或影响药物的稳定性和疗效，甚至对人体健康有害的物质。
2. 药物中存在的杂质其来源主要有两个：
（1）是由生产过程中引入；
（2）是贮存过程中受外界条件的影响，引起药物理化性质发生变化而产生。
3. 杂质限量：（定义）指药物中所含杂质的最大容许量，它通常不要求准确测定其含量，只要在杂质含量在一定限度内。
4. 杂质限量检查法的特点：只需通过与对照液比较即可判断药物中所含杂质量是否符合限量规定，不需测定杂质的准确含量。
5. 一般杂质的检查方法在药典附录中加以规定。一般杂质检查项目有氯化物、硫酸盐、水分、酸、碱、硫化物、硒、氟、氰化物、铁盐、重金属、砷盐、铵盐、易炭化物、干燥失重、炽浊残渣、溶液颜色与澄清度以及有机溶剂残留量等。
氯化物检查法：Cl- ┼ Ag+──→AgCl↓
原理：药物中微量的氯化物在硝酸酸性条件下与硝酸银反应，生成氯化银的胶体微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银混浊程度比较，判定供试品中氯化物是否符合限量规定。
重金属检查法：重金属是指在实验条件下能与硫代乙酰胺或硫化钠作用显色的金属杂质。检查时常以铅为代表。
砷盐检查法：砷为毒性杂质，须严格控制其限量。砷盐的检查主要是古蔡法和二乙基二硫代氨基甲酸银法。中国药典（2000版）和英国药典（1998）主要采用古蔡法检查药物中微量砷。 原理：利用金属锌与酸作用产生新生态的氢，与药物中微量砷盐反应生成具有挥发性的砷化氢，遇溴化汞试纸产生黄色至棕色的砷斑，与同条件下一定量标准砷溶液所生成的砷斑比较，判断砷盐的含量。
溶液澄清度检查法：
级号
0.5
1
2
3
4
浊度标准原液（ml）
2.50
5.0
10.0
30.0
50.0
水（ml）
97.50
95.0
90.0
70.0
50.0
当供试品溶液的澄清度与所用试剂相同或未超过0.5级浊度标准液时，称为澄清；当供试品溶液的乳色比0.5级明显，而不及1级时，称为浊度0.5级；其余依次类推，分别称为浊度1，2，3级。
炽灼残渣检查法：有机药物经炭化或无机药物加热分解后，加硫酸湿润，先低温再高温（700~800℃）炽灼，使完全炭化，有机物分解挥发，残留的非挥发性无机杂质（多为金属的氧化物或无机盐类）成为硫酸盐，称为炽灼残渣（BP称硫酸灰分），称重，判断是否符合限量规定。
干燥失重检查法：
（1） 常压恒温干燥法；
（2）干燥剂干燥法
6. 特殊杂质的检查：P31对于生物药物来说，还有一类特殊杂质需要检查，它们是痕量地存在于生物药物中，对生物体能产生特殊生理作用，严重影响用药安全的杂质，故对这类特殊杂质的检查又称为安全性检查。
生物药物的安全性检查包括：
（1） 异常毒性检查法
（2） 热原检查法
（3） 升压物质检查法
（4）降压物质检查法
（5）致敏物质检查法
第三章 生物药物的微生物限度检查
1. 微生物限度检查：指微生物的染菌不能超过一定限度。
生物药物的微生物限度检查法：染菌检查是严格按照药典规定进行计准检查：
（1）细菌、霉菌、酵母菌数量的检查；
细菌总数的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数量。
霉菌和酵母菌数的测定是考察每克或毫升供试品中所污染的活霉菌和酵母菌数量
（2）控制菌的检查
染菌限度检查原则：检出的菌量较实际菌量偏低
2. 药检结果判断：细菌菌落数、霉菌（酵母菌）菌落数、控制菌三项均符合该品种微生物限
度项下规定，应判供试品合格；其中任何一项不符合该品种项下规定，应判供试品不合格。
3. 控制菌的检查法：
增菌培养：为了以提高各种控制菌的检出率为目的的细菌培养方法。
增菌培养目的：提高各种控制菌的检出率。
大肠杆菌（重点）：流程（每一步做什么，用什么培养基，现象，结论）
（1） 配培养基和稀释液
（2） 供试液的制备
（3）增菌培养（胆盐乳糖培养基），现象：培养基为黄色，有气泡产生
（4）荧光检查（MUG 4—甲基伞形酮葡糖苷酸）现象：当供试品MUG管出现荧光，阳性；无荧光，阴性。
（5）靛基质实验（二甲基氨基苯甲醛）（蛋白胨水培养基）现象：液面呈玫瑰红色为阳性，液面呈试剂本色为阴性【注意：培养基中蛋白胨的质量影响本反应的阳性率，可采用乙醚提取培养液中的靛基质，提高阳性率】
（6）检查结果判断
双阴或双阳 阴/阳或阳/阴
（蛋白荧光玫瑰红色液面） ①分离纯化
②EMB曙红亚甲蓝琼脂
现象：菌落呈紫黑色或紫色为阳性，不着色为阴性。
③麦康凯MacC平板
现象：菌落呈鲜艳的桃红、粉红色为阳性
④革兰染色、镜检、生化试验（乳糖发酵、IMVC）

书写检验记录单
检查结果判断与报告：当空白对照试验呈阴性，阳性对照正常，供试品检查为革兰阴性无芽孢短杆菌；MUG反应为阳性；IMVC试验为++——或—+——，判定为检出大肠杆菌。
沙门菌：特征性试验
（1） 靛基质试验
（2） 脲酶试验
（3）氰化钾试验
（4） 赖氨酸脱羧酶试验
（5）动力检查
（6）血清凝集试验
铜绿假单胞菌：特征性试验
（1） 氧化酶试验
（2）绿脓菌素试验
（3）硝酸盐还原产气试验
（4） 明胶液化实验
（5）42℃生长试验
4. 含抑菌成分的生物药物的菌检方法：主要指抗生素
含抑菌成分供试液的制备：
（1） 稀释法
（2） 离心沉淀集菌法
（3） 薄膜过滤法
（4） 中和法
第四章 酶联免疫测定法在生物药分析中的应用
1. 酶联免疫分析法（ELISA）：是固相免疫测定法，非均相。包括（P63）
（1） 双抗体夹心法
（2） 双位点一步法
（3） 间接法
（4） 竞争法
2. 酶联方法
（1） 戊二醛法
（2）过碘酸钠法
3.ELISA间接法操作步骤：
（1）包被抗原，洗涤
（2）封闭
（3）加抗体，洗涤
（4）酶标抗抗体，洗涤
（5）底物显色
（6）终止反应
（7）检测
第五章 酶法分析
1.酶法分析：利用酶作为分析工具或分析试剂，测定样品中用一般化学方法难以检测的物质（这些物质可以是酶的底物，也可以是酶的抑制剂或活化剂以及酶的辅助因子）的方法。根据测定原理，又分为终点法、反应速度法和循环放大法三大类。
终点法：（定义）先借助酶反应（单独的反应或几种酶构成的耦联酶反应）使被测物质定量地进行转变，在转化完成后，测定底物、产物或辅酶物质（第二底物）等的变化量，因此称为终点测定法，是应用最普遍、最广泛的酶法分析。

酶的循环放大法：（重点掌握）酶循环放大法检测超微量前列腺素（PG）
第一步：转换反应：试样中的PG在过量NAD+存在，经前列腺素脱氢酶PDGH催化进行转换反应，生成与PG相当的NADH
PG+NAD+ 前列腺素脱氢酶 15—脱羧—PG + NADH + H+
第二步：循环反应：用一定的方法除去剩余的NAD+后进行循化反应，在过量的3-磷酸甘油醛、α—酮戊二酸和铵盐存在下，经3-磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶催化。NADH被氧化成NAD+，并生成与NADH量相当的谷氨酸。随后，NAD+又被还原成NADH，并产生与NADH量相当的3-磷酸甘油酸，如果反复进行n次，则蓄积的谷氨酸及3-磷酸甘油酸的量即n倍于NADH
第三步：指示反应：蓄积的谷氨酸在过量NAD+存在下，经谷氨酸脱氢酶能进行指示反应，利用终点法测的谷氨酸的量。
谷氨酸 + NAD+ 谷氨酸脱氢酶（GDH） α—酮戊二酸+ NADH + H+ （由谷氨酸的量及循环次数n则可求出待测物PG的量）
α—酮戊二酸 谷氨酸（Glu）

Glu脱氢酶

NADH+H+ NAD+

3-磷酸甘油醛脱氢酶

3-磷酸甘油酸 3-磷酸甘油醛
第六章 电泳技术
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中有三种物理效应：
（1） 样品的浓缩效应
（2） 分子筛效应
（3）电荷效应
2.蛋白质染色方法：常用的有考马斯亮蓝R250和银染色法
能保持蛋白质活性的方法有：1—苯胺基—8萘磺酸，简称ANS法
3. SDS电泳技术
原理（P122）：SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键。在强还原剂（例如巯基乙醇或二硫苏糖醇）的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成组分它们的多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电的蛋白质—SDS复合物。此复合物所带的SDS负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同种类蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质—SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同的蛋白质亚基—SDS复合物基本上是相同的，约为18A。但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此，这种复合物在SDS—聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷量的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质及其亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15000到200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。
LogM W=—b·mR + K
MW—蛋白质的分子量，mR—相对迁移率，b—斜率，K—截距
在一定条件下，b和K均为常数。由此可见，SDS电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。这个规律对大部分蛋白质是适用的，只有少数蛋白质例外。
等电聚焦技术：利用蛋白质分子或者其他两性分子的等电点的不同在一个稳定、连续的、线性的PH梯度中进行分离分析的一种电泳方法。等电聚焦突出的优点是浓缩效应。
第七章 色谱法
1. 色谱法：（定义）是一种物理或物理化学的分离方法，分离原理是：混合物中各组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相；另一相是携带混合物流过固定相的，称为流动相。当流动相中所含的混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于混合物中各组分在结构和性质上存在差异，他它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差异，因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留时间不同，从而按先后不同次序从固定想中流出而得到分离。这种借助在两相间分配的原理而使混合物中各组分分离的技术，称为色谱分离技术或色谱法，又称层析法。
2. 纸色谱：影响因素：
物质极性的影响
溶剂的影响
PH的影响
滤纸的影响
温度和时间的影响
3. 薄层色谱法
4.高效液相色谱
第八章 抗生素类药物的分析
1. 抗生素的效价：（定义）以它的生物活性如抗生效能来衡量其活性标准，因此以效价的高低作为抗生素质量的相对标准。
2. 抗生素效价的最初衡量标准是用牛津单位衡量青霉素的的质量。牛津单位定义：在标准情况下能完全抑制50ml肉汤培养液中的金黄色葡萄球菌标准菌株（牛津标准菌株）生长的青霉素最低含量为一个牛津单位（即1个生物活性单位，1个单位）。
一个牛津单位（IU）相当于0.6μg青霉素G钠盐所具有的抗生活力，1mg青霉素G钠盐含有1667个牛津单位。
3. 抗生素的效价有两种单位：
（1） 稀释单位
（2）重量单位
4. 抗生素微生物检定用标准品：
标准品：是指与商品同质的纯度较高的抗生素，每mg含有一定的活性单位。用作供试品效价测定时的标准。
国际标准品是经过国际有关机构协议认定的每mg含有一定单位的标准品。单位是国际单位。
5. 抗生素类药物的鉴别：
（1） β-内酰胺类
（2）氨基糖苷类
茚三酮反应：氨苄青霉素，氨基糖苷类
坂口反应：是链霉素水解产物链霉胍的特有反应，在碱性溶液中，链霉胍和8—羟基喹啉（或α—萘酚）分别同次溴酸钠反应，生成的各自产物再相互反应而形成橙红色化合物，加入尿素使颜色稳定。
6. 抗生素效价微生物检定法
（1） 稀释法
（2） 比浊法
（3）琼脂扩散法（即管碟法）
管碟法是目前国际上测定抗生素效价的通用方法，原理：利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散，形成含一定浓度抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比。
7.生物检定是利用对生物体（微生物细胞、细胞、离体组织，整体动物等）所引起的药理作用来测定药物的生物活性或效价的一种方法。生物检定包括微生物检定。

第九章 维生素及辅酶类药物的分析（P237）
维生素C（抗坏血酸）
（一） 鉴别试验 -C=C-TPA
1.利用还原性 维生素C分子中的二个烯醇基（OH OH ）具有强还原性可以被氧化为二酮基，应用这个性质可以进行维生素C的鉴别和含量测定。如硝酸银，2,6-二氯吲哚酚、高锰酸钾、亚甲蓝、氯化汞、磷钼酸。碱性酒石酸酮溶液（婓林试剂）等多种氧化剂均可氧化维生素C，使其转变为去氢维生素C，而这些试剂本身则被还原产生沉淀或发生颜色变化等现象，可用于鉴别。
中国药典采用硝酸银反应和2,6-二氯吲哚酚反应进行鉴别。USP（X XIV）采用婓林试剂反应鉴别。
（二）杂质检查
中国药典、BP（1998）用原子吸收光谱法检查微量铜、铁盐的含量。
（三）含量测定
1.容量分析法
（1）碘量法：抗坏血酸可在酸性溶液中以淀粉为指示剂，用碘标准溶液直接滴定。
（2）2,6-二氯吲哚酚：维生素C在酸性溶液中用2,6-二氯吲哚酚滴定时，滴定至溶液显玫瑰红色时，即为终点，无需另加指示剂。
第十一章 氨基酸与蛋白质药物的分析（p270）
1. 蛋白质含量测定：凯式定氮法、双缩脲法、福林酚法、紫外光吸收法；染色法（如氨基黑、考马斯亮蓝）；荧光激发、氯胺丁、放射性核素计数等灵敏度较高的方法。
（1）凯式定氮法
凯式定氮法常用来测定有机物（如蛋白质、核酸、氨基酸）的含氮量。当含氮有机物与浓硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。分解反应进行的很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进反应，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高沸点。过氧化氢也能加速反应。
消化完了以后，在凯式定氮瓶中加入强碱（氢氧化钠溶液）消化液，使硫酸铵分解，放出氨。用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。然后用强酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子浓度为止。所用强酸的摩尔系数即相当于被测样品中的氨的摩尔数。
凯式定氮法有两种常用方法：常量法和半微量法。
（2）双缩脲法---与肽键反应
双缩脲法也分为两种方法，即常量法和微量法。
① 常量双缩脲法
② 微量双缩脲法
2. 胰岛素（Insulin）的质量分析—效价测定
目前各国药典均采用生物鉴定法作为胰岛素效价测定的法定方法。其中有些国家采用兔血糖法，我国及另一些国家采用小鼠血糖下降法，也有用小鼠惊厥法。
第十二章 多肽因子类药物的分析（P292）
1.多肽药物的鉴别：基因重组药物的鉴别主要采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法。
① SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）----见第六章
② 免疫印迹法（转移电泳、蛋白印迹法、western blot）
2.多肽药物的检查
①肽图检查：肽图分析是指用酶解或化学降解蛋白质后，对生成的肽段进行分离、分析的技术。
②纯度：基因工程产品蛋白质纯度是一项重要指标，但它也是一项相对的指标，需根据实际要求而定，纯度的要求是95%、99%或99.9%，正如化学试剂有化学纯、分析纯或光谱纯度。蛋白质的纯度一般是指是否含有其他杂质蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。--定义
第十三章 酶类药物的分析（P320）
酶是由生物细胞产生的具有催化能力的蛋白质。在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆反应的进行速度，使之尽快达到平衡，而不改变生化反应的平衡点，不改变反应的平衡常数。
1.酶的化学组成
酶是具有生物催化活性的特殊蛋白，可分为简单酶和结合酶两大类。
酶的专一性和催化效率取决于酶蛋白，辅助因子起到对原子、电子或基团的传递作用。
2.酶的活力单位与酶的比活力
（1）酶的活性单位（U）是酶活性高低的一种度量，用U/g或U/ml表示。一个单位（U）定义为：在规定条件下，每分钟转化1umol底物所需要的酶量；当底物包含1个以上的酶作用键时，可定义为每1min内使1umol相关的基因转化所需要的酶量
（2）酶的比活力：是指没毫克酶蛋白所含有的酶活力，用U/mg表示。用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力，比活力越高，表示酶的纯度越高。
比活力=效价单位数/蛋白的mg数
3.酶类药物的鉴别
酶分子均是有特异性生物活性的蛋白质。其鉴别方法有常用的蛋白质鉴别（定性分析）方法，如在碱性条件下的双缩脲反应；茚三酮显色反应；浓硝酸的黄色沉淀反应等（详见第七章）。还有某些用于某种酶的鉴别方法，如酶活性试验、沉淀试验、动物试验等。
第十四章 多糖类药物的分析（P350）
1.粘多糖是指广泛存在于动物体内的复合多糖。粘多糖大多具有不同程度的抗凝血性，肝素的抗凝性最强，肝素是一种多糖。
第十七章 生物制品的质量监控（P401）
1. 生物制品：系指以微生物、细胞、动物、人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术（基因工程，细胞工程，蛋白质工程，发酵工程）制成，用于人类疾病的预防，治疗和诊断。
2. 生物制品质量监控的主要内容（三个方面）
①生物制品的鉴定（鉴定试验）②生物制品的检查（杂质检查）③生物制品的含量测定（生物活性或效价）
第十八章 制剂分析（P427）
1.片剂的常规检查
（一） 一般检查
药典规定的片剂一般检查项目有：①重量差异试验；②崩解时限试验；③片剂的厚度与直径均匀度试验；④硬度试验等等。
（二） 含量均匀度检查法
（三） 溶出度检查法（较难溶物质测）
① 原理：溶出度系指药物从片剂（或胶囊剂）在规定溶剂中溶出的速度或程度。
② 测定用仪器和方法：（1）转篮法（2）桨法等等，其中（1）较常用。
PS：转篮法初试6片，复试再取6片，一共12片。
影响片剂溶出度的因素：（1）药物本身的颗粒越小，则总表面积越大，药物与溶剂接触面积随之增加，溶解速度加快。（2）制剂中所含赋形剂（如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂）的不同，会影响溶出速度。（3）压片时的压力（4）贮存期的影响。
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