荧光定量-课件.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,产品简介,创新技术,操作界面,应用,内 容,Eco,实时荧光定量,PCR,系统由,1975,年诺贝尔生理学和医学奖获得者,David Baltimore,博士和世界著名光子与微细加工专家,Axel Scherer,博士共同研发,产品简介,仪器状态指示灯,固定得光学系统,安全得热盖,高性能反应模块,安全门锁,安静得通风系统,体积:,3234、532 cm,;重量:约,16 Kg,32 cm,34、5 cm,32 cm,产品简介,Eco,结构,马达,该设计从根本上消除了热不均一性和边缘效应,精准得温度控制和卓越得温度均一性提高了数据质量和实验重复性,精准得控温系统,导热元件就是一个中空银槽,中空银槽就是密闭得,内含一种特殊液体导热介质。在,PCR,循环过程中,液体导热介质通过两个反方向搅拌装置驱动,在中空银槽中快速流动,使热量从半导体均匀传递到整个银槽。,创新技术,搅拌浆,Two sets of 48 high-power,fixed LEDs for excitation,48 Blue array,48 Green array,Series of four band pass filters(upgradeable to 5),CCD Array,光学系统,-,光路,创新技术,Eco,独特得校准优化数据质量,光学系统,-,控制过程,创新技术,PCR,之前,:,预扫描(,prescan,),检测,LED,初始光强,基于预扫描,:ALC,调节,LED,发光持续时间,确保每一孔:,在每一循环时有相等得光强激发,减少孔间交叉干扰,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,Blue LED Array,PRESCAN,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,LED excitation time,A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8,B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8,(etc),exposure duration,(milliseconds),LED excitation time,A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8,B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8,(etc),exposure duration,(milliseconds),CYCLE 1,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,创新技术,适应性,LED,控制,(,Adaptive LED Control,ALC,),大家有疑问的，可以询问和交流,可以互相讨论下，但要小声点,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,CYCLE 2,0,cycle 21,Raw fluorescence,LED excitation time,For cycle 20,A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8,B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8,(etc),exposure duration,(milliseconds),cycle 20,Raw fluorescence,LED excitation time,For cycle 21,A1,A2,A3,A4,A5,A6,A7,A8,B1,B2,B3,B4,B5,B6,B7,B8,(etc),exposure duration,(milliseconds),/2,ALC,每循环每孔对荧光光强进行精细调节,创新技术,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,1 2 3 4 5 6 7 8,A,B,C,D,E,F,CYCLE 21,通过,ALC,调整光强优点,色度亮度干扰最小化,改善,PCR,结果得特异性,并减少发射荧光得,%CV,值,对低发射荧光样品,通过增加光强使灵敏度最大化,对高发射荧光样品,通过减少光强扩展检测得线性范围,并避免检测器因饱和而过早老化,独特得图标驱动用户界面,大大简化了实验设计和设置,操作软件,简捷得样品类型设置,操作软件,直观得循环界面,操作软件,绝对定量分析,2、,相对定量分析,-,基因表达差异分析,3、HRM,分析,4、,基因分型,应用,Absolute Quantification,用于分析某未知样本中个某一核酸分子得绝对量值,即通常所说得拷贝数。,应用:,病原微生物或病毒含量得检测,转基因动植物转基因拷贝数得检测,RNAi,基因失活率得检测,Plate Layout,Standard Curve,Relative Quantification,用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达得相对变化。校正样本可以就是一个未经处理得对照或者就是在一个过程研究中处于零时得样本。,应用:,比较经过不同处理样本之间特定基因得表达差异,(,如药物处理、物理处理、化学处理等,),特定基因在不同时间得表达差异,cDNA,芯片或差显结果得确证,Plate Layout,RQ vs sample,高分辨率熔解(,High Resolution Melting,HRM,)分析技术就是基于核酸得物理性质,通过饱和得插入染料监控,DNA,熔解曲线变化而进行分析得一种技术。,扩增子得熔解曲线完全取决于,DNA,碱基序列。只要一个碱基发生了突变,就会改变,DNA,链得解链温度。,HRM,可以区分单碱基差异。,HRM,检测不受突变碱基位点和种类得局限,无需使用序列特异性探针,具有高灵敏度、操作简单、高通量、成本低等优点,HRM,应用主要基于两种技术得进步:,具有精确控温装置和高密度数据采集得仪器(解链温度差异极小,零点几摄氏度,使用高分辨率得仪器才可以检测),双链,DNA,嵌入型饱和荧光染料如,LC Green,HRM,HRM,分析过程,HRM,原始曲线,随着,DNA,熔解,Sybr Green,被释放,荧光信号骤降,导出图,“速率”曲线得最高峰就是分离速率最大得点,即等于熔解温度,应用:,突变发现,/,筛查,/,扫描,SNP,基因分型,/,等位基因区分,物种鉴定,表观遗传学,/DNA,甲基化,微卫星分析,HRM,Genotyping,实验注意事项,仪器20分钟左右开启,预热。,配制PCR体系时,加样一定要准确,加每个样品一定要更换枪头,防止交叉污染,样品板上得膜一定要封好,样品上机之前一定要离心,避免气泡影响实验结果,问题,?,谢谢！,Illumina,公司就是一家集开发,制造及销售用于分析遗传变异和生物功能得综合系统得高科技公司。,1998,年成立,2005,年进入中国,并以惊人得速度不断发展,于,2007,和,2009,年两次入选福布斯杂志评出得美国年度成长速度最快得高科技公司,同时亚太地区也就是,Illumina,全球增长最快得区域。,2010,年,Illumina,并购,Helixes,公司。,厂家简介,14 series of 2 fold serial dilution B-Actin,Fam labeled Taqman probe chemistry,Quantitation,High Resolution Melting,Genotyping 5 distinct clusters observed,GG,CC,DEL,AA,TT,操作软件,开放得平台:支持实时,PCR,得全部应用,包括最具挑战性得高分辨熔解(,HRM,)曲线分析,性能卓越:灵敏得精密控制得光学技术;精准得温度控制技术和极佳得温度均一性;,Cq,值重复性高,数据准确性高,4,色荧光检测:同类产品荧光通道最多,标准化:出厂时已对,SYBR,、,FAM,、,HEX,、,VIC,、,ROX,和,Cy5,等荧光染料进行校正,遵循,MIQE,指导原则,软件:以图标驱动得软件界面,实验设计和设置简单,简洁明了得操作流程只需,3,个步骤,通量:,48,孔反应板,满足绝大多数用户得需求,微量:,520,l,反应体系,节约成本,快速:,40,个循环,40,分钟,小型:结构紧凑、体型小巧,适合个人使用,便宜:同类产品价格最低,产品优势,HRM,分析,嵌入型染料,-,非饱和染料,SYBR Green I,SYBR,Green I,对,PCR,有抑制作用,必需使用低浓度;即使就是高浓度,也不能饱和插入,DNA,双螺旋结构中得小沟,非饱和态结合使染料在熔解过程中发生重排,染料分子重新结合到双链,DNA,得空置位点,造成荧光信号没有变化,特异性下降,HRM,嵌入型染料,-,饱和染料,LC Green,饱和染料在饱和浓度(荧光最大)下,也不会抑制,PCR,;高浓度得染料饱和插入,DNA,双螺旋结构中得小沟,在,DNA,解链过程中就不会发生重排,熔解曲线有更高得分辨率,饱和染料主要有,LC Green,、,LC Green Plus,、,CYTO 9,等,HRM,