免疫沉淀法原理及操作.doc

免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋白质间交互作用的生物技术。这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位中就用到这项技术来纯化ArgBP2蛋白。
其原理是在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharose beads上的proteinA/G，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
免疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，一般采用细胞或组织制备的裂解物；第二阶段是对裂解物进行预处理，免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能高，用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白；最后阶段是免疫复合物的形成与纯化，即在预处理过后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。蛋白A和蛋白G对抗体的Fc段有较高的亲和力。蛋白A/G与抗体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合的即是纯化的抗原抗体复合物。
具体步骤可以如下进行：
（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000r/min离心30 min后取上清；
　　（2） 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
　　（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 r/min速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；
　　（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和MS质谱分析鉴定准备样品。如贺莉等在筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体时就用了这个方法：先利用天然膜蛋白提取试剂盒提取人脐静脉内皮细胞的膜蛋白，然后将提取的膜蛋白与亲和素标记的磁珠在4°C孵育2h，除去与亲和素结合的蛋白。利用磁力架，将上清液转移到EP管中，弃去磁珠。生物素标记的无关对照肽和亲和素标记的磁珠孵育，形成对照肽-磁珠复合物，然后该复合物与上述的上清液在4°C孵育过夜，除去与生物素及二硫键等结合的膜蛋白。利用磁力架,将上清液转移到另一EP管中。生物素标记的GX1肽与亲和素标记的磁珠孵育，形成GX1-磁珠复合物,然后该复合物与EP管中的上清液在4°C孵育过夜，利用磁力架收集上清液,磁珠用100μl漂洗液[50mol/LTRIS-HCl(PH7.5)，150mol/LNaCl，0.1%NP-40]洗两遍。加入30μl1×样品缓冲液到磁珠混合物中，95°C变性10分钟。收集洗脱液，保存于-20°C或-70°C。
除了富集蛋白，如开头所述的纯化蛋白也是常见应用，如李兴华等就用这个方法进行肿瘤相关抗原SC的分离纯化：
（1）单克隆抗体与凝胶耦联。
①将 400μl轻轻搅拌混匀的耦联凝胶加入过滤柱，置于一离心管中离心。0.4 ml 耦联缓冲液洗凝胶柱 2 次。
②以耦联缓冲液稀释单克隆抗体至1μg /μl后加入凝胶柱。于通风柜中，加入还原剂 1μl/100μl，孵育过夜，此过程中需不断轻轻翻转混合。
③离心后将过滤柱置于一新离心管中，加入0.4 ml 耦联缓冲液，轻轻翻转 10 次后离心。
④加入0.4 ml 抑制缓冲液，翻转 10 次并离心。
⑤向凝胶中加入0.4ml 抑制缓冲液。于通风柜中，加入还原剂4μl，孵育30min，此过程中不断轻轻翻转混合。
⑥离心后0.4 ml洗液洗凝胶6次，0.4ml结合缓冲液洗凝胶3次。
（2）抗原的免疫沉淀。
将过滤柱置于新离心管中，向已结合抗体的凝胶中加入粗提抗原样品，4°C过夜（此过程中不断轻轻翻转混合）后离心。将过滤柱置于新离心管中，0.4 ml IP缓冲液洗3次。
（3）目标抗原的洗脱。
向凝胶-抗原抗体复合物中加入200μl 洗脱缓冲液，轻叩混匀后离心。所获样品经过真空干燥适当浓缩后，以A280紫外分光光度法定量，-20°C保存备用。
免疫沉淀还可以用来筛选蛋白，如林小玲等就用免疫沉淀来筛选能与HBDSP蛋白相互作用的肝细胞蛋白④：利用anti-Flag抗体偶联的树脂，同Ad-HBDSP感染后的蛋白裂解液上清结合后，获得树脂沉淀复合物，首先验证 IP 实验中所用的anti-Flag 抗体偶联的树脂能否结合HBDSP-Flag融合蛋白，结果显示树脂能结合有HBDSP-Flag融合蛋白。随后以SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，所得凝胶经考马斯亮蓝染色后进行扫描，获得两组清晰的蛋白条带，比对后获得5条差异的蛋白条带。