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植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
〖实验目的〗
1． 了解创建烟草突变体库的方法；
2． 理解每种方法的基本原理；
3． 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。
〖实验原理〗
随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。
烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建

转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子

筛选T2，获突变子，应为3:1分离

确定T-DNA与突变型共分离的个体

产生纯合后代

克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR)

利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因

基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能）

图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程
TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。

实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图
本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草， 以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗
（一）仪器
高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。
（二）材料
烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂
1. 2×CTAB提取液
100mmol/L Tris-HCl pH8.0
2％（w/v）CTAB
1.4mol/L NaCl
40mmol/L b-巯基乙醇
20mmol/L EDTA
2. TE缓冲液
10mmol/L Tris-HCl pH8.0
1mmol/L EDTA
3. 50´TAE电极缓冲液 1000ml
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/L EDTA 20ml
4. 10％次氯酸钠
5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1)
6. 70％乙醇
7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml
8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml
9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合
10. LB液体培养基
配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入：
胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g
酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g
NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基
大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/L
NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0
KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5
CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6） 0.5
MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1） 0.l
KH2PO4 170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇 100
CoCl2·6H2O 0.025
CuSO4·5H2O 0.025
FeSO4·7H2O 27.8
配制方法
母液：
大量元素（50×） 400mL
硝酸铵 33g；硝酸钾 38g；磷酸二氢钾 3.4g；七水合硫酸镁 7.4g；
铁元素（100×） 200mL
七水合硫酸亚铁 0.556g；七水合EDTA二钠 0.746g；
有机营养（100×） 200mL
Gly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇 2g；烟酸 0.010g；
微量元素（1000×） 200mL
碘化钾 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸锰 3380mg；七水合硫酸锌 1720mg；二水合钼酸钠 44mg；五水合硫酸铜 5mg；六水合氯化钴 5mg；
氯化钙（50×） 400mL 氯化钙8.8g
12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基 ＋ 0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA ＋ 3%蔗糖 ＋ 0.6%琼脂
其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；
NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL；
2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL；
以上激素母液均为0.5mg/mL
13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋ 0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素
14. 抗生素母液的配制
KANA（50mg/mL） 1g KANA溶于20mL蒸馏水；
RIF（50mg/mL） 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL；
STR（30mg/mL） 0.6g STA溶于20mL蒸馏水；
羧苄青霉素（100mg/mL） 2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。
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〖实验步骤〗
I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生
1. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。
II 转基因烟草的培养
1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana 50ug/ml、RIF、STR）， 27℃，180r／min振摇培养过夜。将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝0.2～0.5，用来侵染烟草叶片 。
2. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ 转基因烟草的检测
1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；
2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；
3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20℃出沉淀30～60min，8000rpm离心15min；
4. 弃上清，70%乙醇洗涤2次干燥，避光保存；
5. 加入15μL蒸馏水溶解并电泳检测（0.7%琼脂糖凝胶电泳）；
6. 提取pMDC83rc质粒：
（1）3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清；
（2）加300μL预冷溶液I，颠倒混匀6-8次；
（3）加300μl新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次；
（4）加300μl预冷溶液III，颠倒混匀6-8次；
（5）12000 rpm 15min，转移上清液；
（6）加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min；
（7）弃上清，70%乙醇洗沉淀；
（8）空气干燥，20ml 蒸馏水溶解，-20℃贮存。
7. 对提出的基因组DNA进行PCR扩增；
引物和扩增体系同上述的PCR步骤；
GFP引物
GFP-F: 5’- GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’，
GFP-R: 5’-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-3’
（1）在0.2mlPCR管中，按照下表配制PCR反应体系（25μL）。
无菌水
10×PCR Buffer
dNTP Mixture
GFP-F
GFP-R
Ex-Taq
模板DNA
14.2 ul
2.5μL
1μL
0.5μL
0.5μL
0.3μL
1 ul
（2）按如下程序对转基因烟草、未转基因烟草和阳性质粒进行PCR扩增。
温度℃
94
94
58
72
72
时间sec
30
10
60
60
600
循环30次
8. 琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物
9. 配制1%琼脂糖凝胶， PCR产物10μL上样，同时用2μL DNA Marker作为DNA相对分子质量标准。恒压120V电泳20min。在凝胶成像系统下察看结果（T-DNA载体质粒含有绿色荧光蛋白GFP基因，扩增产物为GFP基因的片段，长735bp）。
10. 剪取相同株烟草小叶片放在紫外灯和荧光显微镜下观察，是否产生绿色荧光。